胶体金、免疫色谱表征和制备
(1)胶体金的结构
胶体金又称金溶胶，是金盐还原成原金后形成的金颗粒悬浮液。金胶体颗粒由基本金核（金原子Au）和包围其的双离子层组成，内层负离子（AuC12-）与金核表面紧密结合，外层由离子的离子层组成。H+层分散在胶体溶液中，使游离金胶体悬浮在溶胶中。
胶体金颗粒的基本金核并不是理想的球形核，较小的胶体金颗粒基本为球形，较大的胶体金颗粒（一般大于30 nm）多为椭圆形。胶体金的颗粒形貌可以使用电子显微镜观察。
(2)胶体金的特性
1、胶体的性质大多数胶体金颗粒的尺寸为1～100nm，细小的金颗粒以单分散状态稳定均匀地悬浮在液体中，形成胶体金溶液。因此，胶体金具有胶体的许多特性，特别是对电解质的敏感性。电解液破坏了胶体金颗粒周围的永久水化层，从而破坏了胶体的稳定状态，分散的单个金颗粒可以聚集成更大的颗粒并从液体中沉淀出来。某些聚合物，例如蛋白质，可以保护金胶体并增加其稳定性。
2、显色性 小颗粒胶体呈红色，但不同粒径的胶体颜色有一定差异。最小的金胶体（2-5 nm）呈橙黄色，中等大小的金胶体（10-20 nm）呈酒红色，较大的金胶体（30-80 nm）呈紫红色。由于这一特性，可以通过肉眼观察金胶体的颜色来粗略地估计金颗粒的大小。
3、吸光性金胶体在可见光区有单一的光吸收峰，该光吸收峰的波长（λmax）在510～550nm范围内，随金胶体的大小而变化粒子。-颗粒金胶体偏向长波长，反之亦然，小颗粒金胶体的λmax偏向短波长。表19-1显示了一些金胶体的λmax。
(3)金胶体的制备
1、制备方法主要采用还原法制备胶体金。氯金酸（HauC14）是主要还原剂，常用的还原剂有柠檬酸钠、单宁酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。根据还原剂的种类和还原强度，可以制备0.8nm至150nm的金胶体。最常用的制备方法是柠檬酸还原法。具体操作方法如下。
(1)首先配制0.01%HauC14水溶液，取100ml，加热煮沸。
(2)边搅拌边加入适量的1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液。
(3)加热煮沸15分钟。此时可以观察到，淡黄色的氯金酸水溶液加入柠檬酸钠后立即变为灰色，然后变为黑色，最后逐渐变为红色。整个过程大约需要 2-3 分钟。
(4)冷却至室温后，用蒸馏水恢复至原体积。
该方法产生粒径范围为 16 至 147 nm 的金胶体。金颗粒的大小取决于制备过程中添加的柠檬酸三钠的量。表19-1为制备四种不同粒径胶体时柠檬酸三钠的添加量。
2. 预防
(1)氯金酸易潮解，故贮存于干燥避光处。
(2)氯金酸对金属有很强的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不要使用金属抹刀称量氯金酸。
(3)金胶体制备所用的蒸馏水应为双蒸水或三蒸水或优质去离子水。
(4)因此，配制金胶体的玻璃容器必须完全清洁，使用前应进行酸洗并用蒸馏水冲洗干净。硅化方法是将其浸泡在5%二氯硅烷的氯仿溶液中几分钟，用蒸馏水冲洗，干燥备用。
（5）胶体金的鉴别和保存：虽然制备胶体金并不困难，但要制作出高质量的胶体金却并不容易。因此，需要对每次配制的金胶体进行检查，主要检查项目包括粒径、粒径均匀性、有无团聚颗粒等。
目视观察是最基本、最简单、最方便的验证方法，但确实需要一定的经验。好的金胶体最好是无色透明的，但如果制备的金胶体浑浊或者液面有漂浮物，这说明本次制备的金胶体有很多颗粒团聚。通过在阳光下仔细观察和比较金胶体的颜色，可以粗略地估计产生的金颗粒的大小。当然，也可以用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径。接头处产生的金胶体最好使用电子显微镜观察，通过选择几个有代表性的标本并拍摄显微照片，可以更准确地确定金胶体的平均粒径。
胶体金可以在干净的玻璃器皿中长期保存，添加少量防腐剂（如0.02% NaN3）有助于保存。储存不当会导致细菌生长并形成团聚颗粒。虽然少量的聚集颗粒并不影响后续胶体金的标记，但可以通过低速离心去除聚集颗粒，以提高标记效率。
2. 免疫金的特性及制备
(一)免疫金的特点
胶体金可以与蛋白质等多种高分子物质结合，在免疫组织化学技术中，胶体金与蛋白质的复合物习惯上称为金探针。当用于免疫测定时，胶体金常常与免疫活性物质（抗原或抗体）缀合，这种胶体金缀合物通常被称为免疫金复合物，或简称为免疫金。
胶体金与蛋白质结合的机制目前还很清楚，一般认为是物理吸附。胶体金颗粒具有一层表面负电荷，通过静电感应与蛋白质表面的正电荷结合。因此，环境pH值和离子强度是影响吸附的主要因素，胶体金颗粒大小、蛋白质分子量、蛋白质浓度等其他因素也会影响蛋白质吸附。
(2)免疫金的制备
1. 使用 0.2mol/LK2CO3 或 0.1mol/LHC1 将胶体金溶液的 pH 值调节至选定值。原则上可以选择待标记蛋白质的等电点或使其呈弱碱性。然而，最佳反应pH值往往需要通过多次实验来确定。
调节胶体金的pH值时，不能将电极直接插入胶体金溶液中，因为胶体金会堵塞pH计的电极，所以最好用聚乙二醇等稳定胶体金。 (PEG,20000)至终浓度0.15，然后重新调节金胶体的pH值。
2、将1/10体积的适当浓度的蛋白溶液加入到胶体金溶液中，室温反应2～5分钟。
盐分会影响胶体金对蛋白质的吸附，导致胶体金聚集，因此如果待标记的蛋白质溶液中离子浓度较高，应使用离子强度较低的蒸馏水，必须通过透析去除盐分。标签。
3. 添加浓度为 0.2% 的 PEG 或 BSA，使游离金胶体饱和。
4. 离心去除上清液中未结合的蛋白质。离心条件根据胶体金颗粒的粒径不同而不同：5nm金颗粒可40000r/min离心1小时，8nm金颗粒可25000r/min离心45分钟，离心30分钟。 能。
5. 轻轻吸出上清液。将沉淀悬浮在含有 PEG 或 BSA 的缓冲液中，使其恢复到原始体积，然后离心。因此，请清洗2-4次。完全去除未结合的蛋白质。
6. 最后使用稀释剂制备免疫金复合物并以工作浓度保存。稀释剂通常是添加了稳定剂的缓冲液。缓冲液通常是中性 PBS 或 Tris 缓冲液。
