影响PCR检测结果的因素
1. 底漆：
引物是PCR中特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA之间的互补程度。
引物的设计应遵循以下原则：
1) 引物长度：15-30 bp，一般在20 bp左右。
(2)引物扩增范围：200-500bp合适，在一定条件下可扩增至10kb的片段。
(3)引物碱基：G+C含量应为40～60%，G+C太少，扩增效果差，G+C太多，易出现非特异条带。优选地，ATGC随机分布，避免多于五个嘌呤或嘧啶核苷酸的簇。
(4) 避免引物内的二级结构和两个引物之间的互补性，特别是在3'端。否则，将形成引物二聚体并产生非特异性扩增带。
(5)引物的3'端碱基，特别是最后一个和倒数第二个碱基必须紧密配对，避免因末端碱基不匹配而导致PCR失败。
(6)引物具有或可以添加合适的酶切位点，待扩增的靶序列具有合适的酶切位点，对于酶分析和分子克隆非常有用，是优选的。
(7)引物特异性：引物必须与核酸序列数据库中的其他序列没有明显的同源性。引物用量：每种引物的浓度为0.1-1umol或10-100pmol。我们建议使用最少量的底漆来达到所需的结果。高引物浓度会导致错配和非特异性扩增，从而增加引物的量和形成二聚体的机会。
2. 酶及其浓度
目前，有两种类型的 Taq DNA 聚合酶：一种是从水生栖热菌中纯化的天然酶，另一种是由大肠杆菌合成的重组酶。催化一次典型的PCR反应大约需要2.5U的酶（总反应体积为100μl）；浓度太高会导致非特异性扩增；浓度太低会导致酶量减少。合成产品将会减少。
3. dNTP 的质量和浓度
dNTP的质量与其浓度和PCR扩增效率密切相关，并且由于dNTP粉末呈颗粒状，如果储存不当，它们会挥发并失去生物活性。由于 dNTP 溶液呈酸性，使用前应配制成高浓度，用 1 M NaOH 或 1 M Tris.HCL 缓冲液调节 pH 7.0-7.5，并分小份保存在 200°C 冰箱中。-20℃。多次冻融循环会降解 dNTP。在 PCR 反应中，dNTP 应在 50 至 200 umol/L 之间。请注意，四种 dNTP 的浓度必须相等（等摩尔制剂），特别是当四种 dNTP 中任何一种的浓度与其他浓度不同（更高或更高）时。低），导致差异。如果浓度太低，PCR产物的收率就会低。dNTPs 可以结合 Mg2+ 并降低游离 Mg2+ 的浓度。
4. 模板（靶基因）核酸
模板核酸的量和纯度是决定PCR成败的关键因素之一，传统的DNA纯化方法通常涉及使用SDS和蛋白酶K对标本进行消化和处理。SDS的主要功能是通过溶解细胞膜上的脂质和蛋白质来溶解膜蛋白，破坏细胞膜，并解离细胞内的核蛋白。SDS还可以结合并沉淀蛋白质，蛋白酶K也可以水解它们。蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，被消化，用有机溶剂苯酚和氯仿提取以去除蛋白质和其他细胞成分，并用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸可用作PCR反应的模板。对于临床常见的实验室标本，用快速简便的方法裂解细胞、裂解病原体、消化去除染色体蛋白释放目的基因，直接进行PCR扩增，即可使用。RNA模板的提取通常使用异硫氰酸胍或蛋白酶K方法来防止RNA被RNA酶降解。
5. Mg2+浓度
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显着影响，在典型的PCR反应中，当各种dNTPs浓度为200 umol/L时，合适的Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L。Mg2+浓度过高会降低反应的特异性，导致非特异性扩增，而浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，导致反应产物减少。。
6.设定温度和时间
根据PCR的三步原理，设定三个温度点：变性-退火-延伸。在标准反应中，双链DNA在90-95°C变性，然后快速冷却至40-60°C，引物退火并与靶序列结合，然后快速加热至70-75°C。聚合酶的作用导致引物链沿着模板延伸。对于较短的靶基因（长度为100-300 bp），可以使用双温度点方法，将变性温度、退火温度和延伸温度结合在一起。一般采用94℃。约 65°C 进行变性，约 65°C 进行退火和延伸（在此温度下 Taq DNase 仍具有较高的催化活性）。
1）变性温度和时间：变性温度低和解冻不完全是PCR失败的主要原因。一般情况下，93°C至94°C 1分钟足以使模板DNA变性，但如果温度低于93°C，可能需要延长时间，但要注意高温时温度不要设置太高。 -温度环境。请。影响酶活性。在此步骤中未能使目标基因模板或PCR产物完全变性将导致PCR失败。
(2)退火(复性)温度和时间：退火温度是影响PCR特异性的重要因素。变性后，温度迅速冷却至 40°C 至 60°C，以使引物和模板结合。由于模板 DNA 比引物复杂得多，因此引物和模板之间发生碰撞结合的可能性远高于模板互补链之间发生碰撞结合的可能性。退火温度和时间取决于引物的长度、其碱基组成和浓度以及目标碱基序列的长度。对于具有 20 个核苷酸和大约 50% G+C 含量的引物，55°C 是选择最佳退火温度的理想起点。引物的退火温度可以通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值（熔化温度）=4（G+C）+2（A+T）
复性温度=Tm值-（5～10℃）
在可接受的Tm值范围内，选择较高的退火温度将显着减少引物与模板之间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。退火时间通常为 30 至 60 秒，足以使引物和模板完全结合。
(3)延伸温度和时间：Taq DNA聚合酶的生物活性：
70~80℃ 150个核苷酸/S/酶分子
70℃ 60个核苷酸/S/酶分子
55℃ 24个核苷酸/S/酶分子
如果温度超过90℃，DNA合成将难以进行。
PCR反应的延伸温度通常选择在70～75℃之间，最常用的是72℃，但如果延伸温度太高，引物与模板的结合将无法正常进行。PCR延伸反应时间可根据待扩增片段的长度来确定，但对于1Kb以下的DNA片段，通常1分钟左右的延伸时间就足够了。3-4 kb 目标序列的扩增需要 3-4 分钟，而 10 kb 目标序列的扩增需要 15 分钟。过长的延伸会导致非特异性扩增带的出现。当扩增低浓度模板时，延伸时间会稍长。
7. 循环次数
循环次数决定了 PCR 扩增的程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般来说，循环次数选择在 30 到 40 之间，循环次数越多，非特定产物的数量就越多。
八、影响PCR特异性的因素
通过以上内容我们可以看出，影响PCR特异性的因素有很多。我总结在这里供大家参考。
(1)退火步骤的严格性：提高退火温度可减少错配杂交并增加特异性。
(2)通过缩短退火时间和延伸时间，可以减少错误引发和延伸。
(3)引物二聚体是最常见的副产物，降低引物和酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物二聚化。
(4)改变MgCl2的浓度可以提高特异性，这可以直接影响反应或taq酶的严格性。
一般认为，PCR产物应在48小时内通过电泳检测到，有些PCR产物最好通过当天的电泳检测到，但48小时后条带图案可能会不一致，它们可能会出现在规则中甚至消失。
