影响PCR检测结果的因素
1. 底漆：
引物是PCR中特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA之间的互补程度。
引物的设计应遵循以下原则：
1）引物长度：15-30 bp，通常在20 bp左右。
(2)引物扩增跨度：200-500 bp为宜，在特定条件下可扩增至10 kb的片段。
(3)底漆碱基：G+C含量应为40-60%。如果G+C太少，扩增效果不好，如果G+C太多，则容易出现非特异性条带。ATGC优选随机分布，避免超过5个嘌呤或嘧啶核苷酸的簇。
(4)避免引物内部存在二级结构，避免两个引物之间存在互补性，特别是3'端的互补性，否则会形成引物二聚体，产生非特异性扩增条带。
(5)引物3'端的碱基，特别是最后一个和倒数第二个碱基应严格配对，避免因末端碱基不匹配而导致PCR失败。
(6)引物中存在或可以添加合适的酶切位点。待扩增的靶序列最好具有适当的酶切位点，这对于酶分析或分子克隆非常有利。
(7)引物的特异性：引物应与核酸序列数据库中的其他序列无明显同源性。引物用量：每种引物的浓度为0.1-1umol或10-100pmol。最好使用最低的引物量来产生所需的结果。高引物浓度会导致错配和非特异性扩增，并且会增加引物的量。有机会形成二聚体。
2. 酶及其浓度
目前可用的Taq DNA聚合酶有两种，一种是从水生栖热菌中纯化的天然酶，另一种是由大肠杆菌合成的基因工程酶。催化典型的 PCR 反应大约需要 2.5 U 的酶（当总反应体积为 100 ul 时）。浓度过高会造成非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
3. dNTP的质量和浓度
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率密切相关。dNTP粉末呈颗粒状，如果储存不当，会挥发而失去生物活性。dNTP溶液呈酸性，使用前应配制高浓度。用 1 M NaOH 或 1 M Tris.HCL 缓冲溶液将其 pH 调节至 7.0-7.5，少量等分，并储存在-20℃冰箱中。多次冻融循环会降解 dNTP。PCR反应中，dNTP应为50-200umol/L，特别注意四种dNTP的浓度应相等（等摩尔配制），如果其中任何一种的浓度与其他不同（高或高）低），导致不匹配。如果浓度太低，PCR产物的产量会降低。dNTP可以与Mg2+结合，降低游离Mg2+的浓度。
4. 模板（靶基因）核酸
模板核酸的量和纯化程度是PCR成败的关键环节之一。传统的DNA纯化方法通常使用SDS和蛋白酶K来消化和处理标本。SDS的主要作用是溶解细胞膜上的脂质和蛋白质，从而溶解膜蛋白并破坏细胞膜，并使细胞内的核蛋白解离。SDS还可以与蛋白质结合并沉淀；蛋白酶K可以水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，用有机溶剂苯酚和氯仿提取，除去蛋白质和其他细胞成分，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸可作为PCR反应的模板。对于一般临床检测标本，可以采用快速、简单的方法裂解细胞、裂解病原体，消化去除染色体蛋白，游离出目的基因，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，以防止RNase降解RNA。
5. Mg2+浓度
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显着影响。一般PCR反应中，当各种dNTP浓度为200 umol/L时，合适的Mg2+浓度为1.5-2.0 mmol/L。如果Mg2+浓度过高，会降低反应的特异性，出现非特异性扩增。如果浓度太低，Taq DNA聚合酶的活性会降低，反应产物也会减少。
6. 温度和时间的设定
根据PCR的三步原理，设置了变性-退火-延伸三个温度点。标准反应采用三温点法。双链DNA在90-95℃变性，然后快速冷却至40-60℃。引物退火并与靶序列结合，然后快速加热至70-75°C。在聚合酶的作用下，引物链沿着模板延伸。对于较短的靶基因（当长度为100-300 bp时），可以采用两温度点法。除了变性温度外，还可以将退火温度和延伸温度合二为一。一般变性用94℃，退火和延伸用65℃左右（此温度Taq DNase仍具有较高的催化活性）。
1）变性温度和时间：变性温度低、熔解不完全是PCR失败的主要原因。一般来说，93°C~94°C 1分钟足以使模板DNA变性。如果低于93℃，则需要延长时间，但温度不宜过高，因为高温环境会影响酶的活性。如果此步骤不能使目的基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
(2)退火(复性)温度和时间：退火温度是影响PCR特异性的重要因素。变性后，将温度快速冷却至40°C-60°C，以使引物和模板结合。由于模板 DNA 比引物复杂得多，因此引物和模板之间碰撞结合的机会比模板互补链之间碰撞结合的机会高得多。退火温度和时间取决于引物的长度、其碱基组成和浓度以及目标碱基序列的长度。对于具有20个核苷酸且G+C含量约为50%的引物，55°C是选择最佳退火温度的理想起点。底漆的退火温度可以通过以下公式来帮助选择合适的温度：
Tm值（熔化温度）=4（G+C）+2（A+T）
复性温度=Tm值-(5~10℃)
在Tm值允许的范围内，选择较高的退火温度可以大大减少引物与模板之间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。退火时间一般为30-60秒，足以使引物与模板完全结合。
(3)延伸温度和时间：Taq DNA聚合酶的生物活性：
70~80°150个核苷酸/S/酶分子
70°60个核苷酸/S/酶分子
55°24个核苷酸/S/酶分子
当温度高于90℃时，DNA合成几乎无法进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间，常用的温度为72℃。过高的延伸温度不利于引物与模板的结合。PCR延伸反应的时间可以根据待扩增片段的长度来确定。一般来说，对于1Kb以内的DNA片段，延伸时间1分钟就足够了。3-4kb的目标序列需要3-4分钟；扩增 10 Kb 的目标序列需要 15 分钟。过长的延伸会导致非特异性扩增带的出现。低浓度模板扩增时，延伸时间稍长。
7. 循环次数
循环次数决定了 PCR 扩增的程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般循环次数选择在30～40次之间，循环次数越多，非特定产物量增加越多。
8. 影响 PCR 特异性的因素
通过以上内容可以看出，影响PCR特异性的因素有很多，这里我们做一下总结，供大家参考：
(1)退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少错配杂交，从而提高特异性。
(2)缩短退火时间和延伸时间可以减少假引发和假延伸。
(3)引物二聚体是最常见的副产物，降低引物和酶的浓度也可以减少错误引发，特别是引物二聚化。
(4)改变MgCl2的浓度可以提高特异性，这可能对反应的严格性或对taq酶有直接影响。
一般认为PCR产物应在48小时内进行电泳检测，有的最好当天进行电泳检测。48小时后，条带图案会出现不规则甚至消失。
