甲基化特异性 PCR：过程问题和控制！
一、亚硫酸氢钠重整过程中可能出现的问题及对策
亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5-甲基胞嘧啶保持不变。影响这一过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的pH值和反应时间。任何一条链路出现问题都会导致复用段保护（MSP）放大失败。
体验如下：
(1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3.0-3.9mol/L，并用NaOH准确调节pH值至5.0。
(2)修饰时间应在10～16小时内调整，修饰时间太长，甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，增加对DNA模板的损伤，修饰时间太短，修饰不完成。
（3）反应温度控制在50-55℃（如果使用家用恒温水浴锅，建议温度设置为53℃）。
(4)DNA模板量应调整至<2ug。
只要按照上述操作，基本上99%的未甲基化胞嘧啶都会转化为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶则保持不变。然而，在这个转化过程中，大约 96% 的模板 DNA 被降解，当 DNA 样品较小时（石蜡包埋组织、血清 DNA、 ETC。）。它作为载体添加以帮助 DNA 沉淀（添加载体后，轻轻摇动 Eppendof 管以检查聚集和 DNA 浓度）。
2. 甲基化特异性PCR存在的问题及解决方案
1.引物因素分析 MSP引物设计的质量是扩增成功的关键因素。
MSP的引物设计与一般PCR引物不同，MSP的引物设计原理是模板DNA经过亚硫酸盐处理后，甲基化基因启动子区CpG岛的CpG位点5端胞嘧啶为与未甲基化的 CpG 岛中的 CpG 结合。该位点的 5 末端胞嘧啶转化为尿嘧啶或 CU。根据修饰前后核苷酸序列差异，利用MethPrimer软件设计甲基化和非甲基化引物，并进行PCR扩增。MSP引物序列至少含有1个CpG位点，优选多个CpG位点，以保证引物的特异性，提高DNA启动子甲基化碱基的检出率。MSP引物应根据亚硫酸氢钠处理后的DNA序列进行设计，并尽可能符合通用PCR引物设计原则。根据MSP的要求，用MSP扩增一条DNA序列时，至少要合成两对引物：甲基化引物和非甲基化引物。在MSP的非甲基化引物序列中，前导引物不含有鸟嘌呤碱基，反向引物不含有胞嘧啶碱基。对于 MSP 新手来说，最好使用介绍性文献。如果在文献中找不到相应的MSP引物来筛选新的甲基化抑癌基因，可以使用在线MethPrimer软件在线设计引物。按照软件提示找到您需要的 MSP 引物。但MSP遇到的困难是，需要扩增的是启动子或第一外显子序列的部分，其CG含量比较高，使得MSP扩增比较困难，所以最好使用引物软件。通过像Primer 5.0一样从理论上猜测扩增效率，我们优化扩增效率小于30%的引物，以提高扩增效率并降低扩增难度，从而提高PCR产量。
试剂研发：蛋白质保护剂
2、MSP反应体系存在的问题 MSP的反应体系组成与通用PCR相同，反应体系的优化也与通用PCR类似，但反应体系与通用PCR最大的区别是普通PCR的反应体系是DNA模板与普通PCR的反应体系不同。
修饰后的模板呈单链状态，提取后必须检测MSP DNA模板的纯度和含量，纯度应为A260/A280 1.8~2.0，如果DNA模板添加过多，MSP扩增会失败，如果DNA模板添加太少，MSP扩增就会失败，一方面浪费试剂，另一方面目标片段太少导致MSP假阴性。Mg"浓度一般为2.0-2.5mmoL/L，太低或太高都不利于扩增。另外，PCR缓冲液和Taq酶的来源也很重要，常见的PCR缓冲液经常导致结果不稳定，其他来源的Taq酶也会影响结果的重现性，对于富含CG的复杂二级结构模板，我们推荐使用TaKaRa公司的TaKaRa IATAq和Takara公司的GC Buffer，更换方便，避免因时间和金钱的浪费到MSP.重新优化。
3. MSP 的反应温度 MSP 扩增结果分三种情况进行分析。
(1)产物电泳呈阴性。
（2）产物电泳存在多条非特异条带（包括目的基因条带）；
(3)产物电泳呈阳性（仅目的基因条带）。当出现前两种情况时，在反应体系和引物没有问题的条件下，通过调节MSP的反应温度就可以得到想要的基因条带。
就是这样：PCR反应中，Tm的水平与CG的含量呈正相关。甲基化和非甲基化引物之间的序列差异可能会导致扩增过程中 PCR 偏差。建议将预变性温度（通常 >95°C，比率 10）和变性温度（>95°C，1 分钟）和退火温度提高至 60°C（对于梯度）和 70°C（对于降落 PCR）。
试剂研发：蛋白质保护剂
总之，MSP的整个过程比普通PCR有更多的影响结果的因素，只要仔细控制实验过程的每一步，就可以充分提高MSP的准确度和精密度。
谈谈个人看法：
(1)亚硫酸氢钠的浓度宜调节至3.0～3.9mol/L。（我们实验室的亚硫酸盐大于这个浓度）。
(2)修饰时间应在10～16小时内调整，修饰时间太长，甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，增加对DNA模板的损伤，修饰时间太短，修饰不完成。（我对此很深，因为正如上面提到的，我怀疑即使经过4小时也可能无法完成修改。所以我分别做了6小时、12小时和6小时。事实上，修改时间是这样的长的模板损坏严重，2周就恶化了，当时P是M，后来必然变成P出U了。
(3)DNA模板量调整至2g以下。（主要是为了美容）
