CRISPR，与层析试纸结合应用

CRISPR诊断被称为下一代分子诊断技术。美国FDA和中国NMPA均已向用于新冠诊断的CRISPR诊断平台颁发EUA授权。上海伯杰医疗的“恒温CRISPR新冠快速检测试剂盒”获批的消息，进一步鼓舞了大家。对 CRISPR 诊断的热情。

CRISPR诊断主要包括样本预处理（包括预扩增）、靶标识别、信号释放和检测。

本文将主要介绍CRISPR诊断方法中使用的侧流信号报告系统

1.带瞄准镜的CRISPR霰弹枪！

CRISPR技术应用于分子诊断主要是因为特异性：在向导RNA的指导下，CRISPR-Cas蛋白在识别目标序列方面具有优异的特异性，甚至可以准确区分单碱基差异。

此外，Cas蛋白接触靶序列后，会被激活，具有无差别反式切割活性，高效无差别切割周围所有可切割核酸序列，从而放大信号。

兼具特异性识别和无差别切割功能的CRISPR诊断系统，简直就是一把带瞄准镜的猎枪。

图1. Cas蛋白识别和切割靶序列示意图。图片取自Mammoth Bio官网。Cas蛋白通过向导RNA特异性识别并结合靶序列（对于dsDNA靶标，需要PAM序列），形成三元复合物，在顺式切割靶序列的同时激发反式切割活性，并将周围的序列转化为三元复合物。核酸序列进行任意切割。目前已鉴定的具有顺式和反式切割活性的Cas蛋白主要集中在Cas12和Cas13蛋白，它们分别识别（/切割）DNA序列和RNA序列。

2. CRISPR信号报告系统

由于Cas蛋白只有特异性识别并结合目标序列后才会切割周围的核酸序列，因此可以通过检测报告序列是否被切割来判断待测系统中是否存在目标序列。

几乎所有的CRISPR诊断方法都是通过在系统中添加一些可检测的外源探针来完成诊断过程。

侧流层析试纸条

张峰团队推出了SHERLOCKv2，引入核酸试纸作为信号报告系统，非常方便POCT使用。

他们在探针的两端引入了两个小分子标记 FAM 和生物素。他们使用的市售核酸试纸条上用胶体金标记了抗FAM抗体，NC膜上的检测线涂有可以结合生物素的链霉亲和素。该方法可检测同时含有 FAM 和生物素的核酸扩增产物。

张峰团队首创对试纸本身的解读，利用夹心试纸的质控线作为检测线，检测探针是否被剪断。

他们调整了探针的浓度，使得当探针没有被切断时，所有的胶体金都集中在下面的线上，而一旦探针被切断，胶体金就会越过下面的线到上面的线显色。