甲基化特异性 PCR：过程问题和控制！
1、亚硫酸氢钠重整过程中可能出现的问题及对策
亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5-甲基胞嘧啶保持不变。影响这一过程的主要因素是改性剂的浓度、反应温度、反应环境的pH值和反应时间。任一链路出现问题都会导致 MSP 放大失败。
体会如下。
(1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3.0-3.9mol/L，其pH值必须用NaOH准确调节至5.0。
(2)修改时间应控制在10-16小时内。如果修饰时间过长，甲基化的胞嘧啶也会转化为尿嘧啶，加剧对DNA模板的损伤。如果时间太短，变化就会不完整。
（3）控制反应温度在50～55℃（如果使用家用恒温水箱，建议设定在53℃）。
(4)DNA模板量应控制在2μg以下。
只要遵循以上几点，基本上可以保证99%的未甲基化胞嘧啶会转化为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶保持不变。然而，大约 96% 的模板 DNA 在此修饰过程中被降解，因此如果 DNA 样品较小（石蜡包埋组织、血清 DNA 等），请使用适量的鲑鱼精子 DNA 或糖原（约 1 g） ）。 可以做。作为载体添加，促进DNA沉淀（添加载体后轻轻摇动Eppendorf管，确认有絮状DNA浓缩现象）。
2. 甲基化特异性PCR可能出现的问题及对策
1. 引物因素分析 MSP引物设计的质量是扩增成功的关键因素。
MSP的引物设计原理与普通PCR引物不同，是用亚硫酸盐处理模板DNA后，修饰甲基化基因启动子区CpG岛CpG位点的5端胞嘧啶。保持不变，但未甲基化 CpG 岛中 CpG 位点的 5 末端胞嘧啶转化为尿嘧啶或 CU。利用MethPrimer软件根据修饰前后序列的差异设计甲基化引物和非甲基化引物，并进行PCR扩增。MSP引物序列含有至少一个或多个CpG位点，优选多个CpG位点，以保证引物特异性，提高DNA启动子甲基化碱基的检出率。MSP引物应根据亚硫酸氢钠处理后的DNA序列进行设计，并应尽可能符合通用PCR引物设计原则。根据MSP要求，用MSP扩增DNA序列时，至少必须合成两对引物：甲基化引物和非甲基化引物。在MSP的非甲基化引物序列中，前导引物不含有鸟嘌呤碱基，反向引物不含有胞嘧啶碱基。对于那些刚接触 MSP 的人来说，最好使用文献介绍。为了筛选新的甲基化抑癌基因，如果文献中没有找到相应的MSP引物，可以利用在线MethPrimer软件在线设计引物。按照软件提示找到您需要的 MSP 引物。不过MSP的难点在于，需要扩增的部分是启动子或者第一外显子序列，由于其CG含量比较高，扩增起来比较困难，所以最好使用primer软件。Primer 5.0等引物从理论上估算扩增效率并优化引物，使扩增效率低于30%，提高扩增效率，降低扩增难度，提高PCR产率。
试剂研发：蛋白质保护剂
2、MSP反应系统存在的问题 MSP的反应系统配置与普通PCR相同，反应系统的优化也与普通PCR相同，但与反应最大的区别是优化之处在于，与PCR反应体系的不同在于DNA模板不同。
修饰后的模板处于单链状态。提取后应测试 MSP DNA 模板的纯度和含量。纯度要求 A260/A280 为 1.8 至 2.0。在某些情况下，DNA 处理可能不完整。添加过多的 DNA 模板会导致 MSP 扩增失败，而添加过少的 DNA 模板会因目标片段过少而导致 MSP 假阴性，同时浪费试剂。Mg"浓度一般为2.0-2.5 mmoL/L，太低或太高都不会导致扩增。另外，PCR缓冲液和Taq酶的来源也很重要，普通的PCR缓冲液往往会得到不稳定的结果。,不同来源的Taq酶也会影响结果的重现性，对于富含CG的复杂二级结构模板，使用Takara公司的GC Buffer我们推荐使用TaKaRa IATAq，易于更换和重新优化，避免MSP浪费时间和金钱。
3. MSP 反应温度 MSP 扩增结果可分三种情况进行分析。
(1)产物电泳呈阴性。
(2)产物电泳存在多条非特异性条带（包括目的基因条带）。
(3)产物电泳呈阳性（仅目的基因条带）。上述两种情况，如果反应体系或引物没有问题，可以通过调节MSP反应温度来获得目的基因条带。
方法如下。PCR反应中，Tm的水平与CG的含量呈正相关。甲基化和非甲基化引物之间的序列差异可能会在扩增过程中引入 PCR 偏差。建议将预变性温度（通常 >95°C，10 分钟）、变性温度（>95°C，1 分钟）和退火温度提高至 60°C（对于梯度）和 70°C（对于降落 PCR）。
试剂研发：蛋白质保护剂
也就是说，在MSP的整个过程中，影响结果的因素比常规PCR更多，所以只要仔细控制实验过程的每一步，就可以彻底提高MSP的准确度和精密度。
谈谈我个人的看法：
(1)亚硫酸氢钠的浓度优选控制在3.0～3.9mol/L。（我们实验室的亚硫酸盐高于这个浓度）。
(2)修改时间应控制在10-16小时内。如果修饰时间过长，甲基化的胞嘧啶也会转化为尿嘧啶，加剧对DNA模板的损伤。如果时间太短，变化就会不完整。（我完全理解这一点，因为如上所述，修复可能不会在4小时内完成，所以我分别运行了6小时、12小时和6小时。事实上，修复时间是模板损坏太长了两周就恶化了，当时P是M，但是之后U中就只出现了P。Ta。
(3)DNA模板量应控制在2g以下。（主要是为了修饰）
