8种单核苷酸变异（SNP）检测方法！

桑格测序是DNA序列分析的经典方法，可以直接获取核酸序列信息，是SNP检测的“金标准”。而且，桑格测序可以发现未知的SNP位点，并确定SNP的突变类型和突变位置。是目前最直接、最准确、无法替代的SNP检测方法。

使用测序方法检测SNP时，首先可以通过PCR扩增含有SNP位点的目标序列，形成DNA片段，然后通过Sanger测序获得目标区域的核酸序列，并得到SNP位点。可以比较。确定是否存在突变位点。

桑格测序是基于双脱氧核糖核苷酸（ddNTP）末端终止法进行检测。即在四个独立的反应体系中，分别掺入四种不同颜色标记的A、T、G、C双脱氧核苷酸，使核苷酸在某一固定点开始伸长，如果在反应过程中掺入ddNTP，则伸长率会增加。过程中，由于碱基上缺少3'-OH，延伸无法继续，因此会随机停在特定碱基处，形成一系列不同长度、相差一个碱基的核酸片段，然后用毛细管电泳将这些不同长度的核酸片段分开，最后通过不同碱基标记的颜色读取待测核酸的碱基序列，从而获得目标区域的核苷酸序列。

TaqMan 探针是一种双标记、自猝灭水解探针。其5'端和3'端分别标记有荧光基团和猝灭基团。当探针结构完整时，两者之间的距离比较近，荧光基团信号可以被猝灭。在PCR扩增过程中，如果TaqMan探针与目标序列完全匹配，则探针可以结合在DNA模板上。此时，当Taq酶延伸到探针位置时，其核酸外切酶活性会切割水解的探针，释放荧光团，导致荧光信号增强。而且随着扩增产物的增加，荧光信号越来越强，使得仪器可以实时监测荧光信号的变化过程。

对于双等位基因SNP，可以分别设计两个相应的探针。只有当探针与模板完全匹配时，探针才能在扩增过程中被水解，产生强烈的荧光信号。如果目标序列之间存在错配，荧光强度就会减弱，因此可以通过荧光强度来检测SNP位点。

由于MGB探针的长度可以设计得更短，有利于提高探针的识别特异性，因此用于检测SNP的TaqMan探针常常用MGB进行修饰。但在测试过程中，需要筛选的探针较多，且探针合成的成本较高。

扩增阻滞突变系统PCR（Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMS-PCR），又称等位基因特异性PCR（Allele-Specific PCR，AS-PCR），是基于Taq DNA聚合酶无法修复引物3'的事实末端单碱基错配阻止扩增的检测方法。扩增过程中，只有引物3'端碱基与SNP位点的等位基因互补，扩增才能正常延伸；当不存在互补配对时，不发生扩增反应，通过凝胶电泳或荧光PCR检测扩增产物，从而确定SNP基因型。

在ARMS-PCR的基础上，还发展了一些改进的方法，如四引物扩增阻滞突变系统PCR（tetra-primer扩增阻滞突变系统PCR，Tetra-primer ARMS-PCR）。该方法设计了4条引物，其中2条为内部引物，其3'端位于SNP位点，且2条引物方向相反，属于不同基因型；另外两个是通用外引物，两个引物兼容的SNP点之间的距离应该不同。这样，反应过程中，如果4个引物都与模板完全匹配，则可以扩增出3个不同长度的产物（两个内部引物位于同一位点，不会形成长片段扩增产物）；如果两个内部引物之一与模板不匹配，则只会形成两种不同长度的产物。因此，可以根据电泳后产物的大小来判断基因型。

但由于凝胶电泳检测时间较长，且产品分析时开盖可能造成污染，目前市场上采用ARMS-PCR方法开发的产品大多采用实时荧光PCR进行闭管检测。ARMS-PCR法的荧光PCR检测中，也使用TaqMan探针，但SNP位点设计在引物的3'端，所以理论上只有当引物的3'端与模板完全匹配时，扩增才会发生。可以形成曲线；但在实际检测中，单碱基错配仍然可以被延伸和放大，但效率较低。为了提高其特异性，有时需要在引物3'端附近人为引入错配碱基，以降低非目标序列的扩增效率。

Molecular Beacon是一种双标记寡核苷酸探针，其5'端和3'端分别标记有荧光基团和猝灭基团，并且探针5'端和3'端的一些碱基可以互补，因此形成茎环结构，使得荧光基团和猝灭基团距离较近，荧光信号较低。分子信标的环状结构部分包含SNP检测位点。当模板与分子信标环状结构的核酸序列完全匹配时，分子信标可与模板杂交，形成延伸态，导致荧光基团和猝灭基团的空间距离增大，荧光信号增强，因此可以通过仪器检测并确定SNP位点。

通过使用不同的荧光团标记分子信标，可以区分SNP类型。该方法类似于TaqMan探针方法，通过探针中单个碱基的识别能力来区分SNP。只不过分子信标采用了茎环结构，而TaqMan探针则经过MGB修饰，提高了探针对SNP识别的特异性。

高分辨率熔解分析（high-resolution Melting Analysis，HRM）是通过特定染料与扩增产物结合形成特定熔解峰进行分析检测的方法。采用的特殊材料是饱和荧光染料，具有更强的DNA结合能力，并且不影响PCR扩增，并且在DNA熔解过程中不会重排，使得熔解曲线具有更高的分辨率。

核酸片段的固有特征，如DNA序列的长度、GC含量、碱基互补性差异等都会影响高分辨率的熔解曲线，与高精度荧光定量PCR仪结合，其分辨率精度可以达到单碱基差异的分化，可以用来确定SNP位点。

酶切扩增多态性序列（CAPS）又称限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（PCR-RFLP），是PCR技术与RFLP技术相结合的检测方法。该方法根据DNA片段在限制性位点的碱基变异，利用相应的限制性内切酶消化DNA片段的PCR扩增产物，产生不同的电泳图谱，从而确定SNP位置。点的基本类型。

CAPS只能检测位于限制位点内的SNP，而不能检测限制位点外的SNP。为了解决这一缺陷，对于那些CAPS无法检测到的SNP位点，可以采用衍生的切割扩增多态序列（dCAPS）进行检测，即通过在引物上引入错配碱基来创建酶切位点，然后实现多态性检测。

SNaPshot是美国Applied Biotechnology（ABI）开发的商业技术。它是一种基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术。这种方法也称为小测序。其引物设计的关键是延伸引物的3’端应靠近SNP位点，针对不同的SNP位点可以设计不同长度的延伸引物，从而通过引物的长度来区分SNP位点。引物。

检测过程中，多重 PCR 扩增在包含测序酶和四种荧光标记的 ddNTP 系统中进行。由于添加的核苷酸为双脱氧核糖核苷酸，引物在延伸一个碱基后终止，延伸产物经过Sequencer检测，可以根据峰移动的位置确定延伸产物对应的SNP位点，以及SNP的碱基类型根据峰的颜色可以确定位点。

KASP（竞争性等位基因特异性PCR）是一种基于引物末端碱基特异性匹配来检测SNP的方法。该方法与传统荧光PCR的不同之处在于引物和探针的设计。对应的上游引物，引物的3'端位于各自的SNP位点，引物的5'端各自有独特的标签序列，而下游引物是常规设计的共享引物；其次，设计两条与上游引物标记序列相同的荧光探针，探针的5'端分别标记不同的荧光基团，并与荧光探针对应设计相应的猝灭探针，探针的3'端分别标记不同的荧光基团。淬灭探针是末端标记的淬灭基团。因此，当扩增未开始时，荧光探针与猝灭剂探针结合，荧光基团和猝灭剂基团彼此靠近，因此不能产生荧光信号。当设计的上游引物中的一两个与模板完全匹配时，即可开始扩增，然后将扩增产物与下游引物结合进行扩增，形成含有标签序列的DNA片段；DNA片段可以与荧光探针结合，以荧光探针的3'端作为引物启动扩增，最终形成荧光标记的扩增产物，与荧光探针对应的猝灭探针为在扩增过程中被激活。它被切割，使得扩增过程的荧光信号增强，可以检测到SNP位点。

KASP方法针对上游引物标记序列合成两个通用荧光探针和两个通用猝灭探针，然后组合针对不同SNP位点的特异性引物，以检测多个SNP位点。