常见等温扩增技术的优缺点！
近年来，随着分子生物学技术的快速发展，大量基于核酸检测的诊断方法被建立并广泛应用于疾病的实验室检测，等温扩增技术就是其中之一。
与其他核酸扩增技术相比，等温扩增具有快速、高效、特异、不需要特殊设备等优点。因此，它一出现就被很多学者认为是一种可能与qPCR相媲美的检测方法。
等温扩增技术发展迅速，种类复杂。为了方便大家学习和理解，本文总结了目前常见的等温核酸扩增技术：LAMP、NERA、NASBA、RCA、HDA、RPA和ERA。同时对经典PCR技术和几种恒温核酸扩增技术进行了比较。
为了选择性地开发和利用该技术，现对这些等温扩增技术的原理、特点和应用进行简要总结。
聚合酶链式反应 (PCR)
聚合酶链式反应（PCR）是利用耐高温DNA聚合酶（Taq酶）在不同温度下循环模板DNA、引物、脱氧核苷三磷酸（dNTP）和缓冲液，实现双链DNA的分离，引物结合到互补区上模板，最后在DNA聚合酶的作用下，将脱氧核苷三磷酸一一添加到新合成的DNA链上。
PCR是利用DNA在体外95℃高温变性°C 变成单链。低温时（通常在 60 左右）°c)、引物和单链按照互补碱基配对的原理进行组合，然后将温度调节至DNA聚合酶最适宜的温度。反应温度（约72°C)、DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶的PCR仪实际上是一个温度控制装置，可以很好地控制变性温度、复性温度、延伸温度。
环介导等温扩增 (LAMP)
环介导等温扩增的扩增原理是基于DNA在65℃左右处于动态平衡状态。°C. 当任意引物对双链DNA的互补部分进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，成为单链。在此前提下，使用4个不同的特异性引物来识别靶基因的6个特定区域。在链置换DNA聚合酶的作用下，从外引物片段的3'端开始，与模板DNA互补序列对结合，启动链置换DNA合成。
灯的优点：
（1）扩增效率高，1小时内可有效扩增目的基因1-10个拷贝，扩增效率是普通PCR的10-100倍。
(2)反应时间短、专一性强、无需特殊设备。
灯的缺点：
(1)对底漆的要求特别高。
(2)扩增产物不能用于克隆和测序，只能用于判断。
(3)由于其敏感性强，特别容易形成气溶胶，造成假阳性影响检测结果。
切口核酸内切酶恒温扩增技术（NEAR）
切口核酸内切酶恒温扩增技术（NEAR）是研究最少的一种恒温核酸扩增技术。它由 Ionian Technologies 的研究人员于 2008 年开发并获得专利（Brain et al. 2009）。Ionian是一家成立于2000年的加州初创公司，2010年被Alere收购。随后Alere于2017年被雅培收购，NEAR成为雅培的专利。
NEAR是一种链置换扩增技术。其原理是以dNTPs为原料，在切口核酸内切酶形成的裂解处通过聚合酶的作用，从裂解的3'端聚合延伸，取代等位基因DNA。链，从而形成包含切口酶识别位点的新的完整DNA序列。这条双链再次被核酸内切酶识别并切割，然后开始“聚合-切口”的循环，产生大量移位的DNA单链，形成指数扩增。
NERA的优势：
（1）快速（最快5分钟内即可得到阳性结果）。
(2)灵敏度高（最初只需要数百个病毒拷贝）。
(3)与引物设计较为复杂的LAMP技术不同，NEAR技术具有多种反应形式，可以满足不同的扩增要求。
(4)反应稳定性好。
NEAR的缺点：
(1)短序列的设计存在较高的误报可能性。
(2)反应机理复杂，产物收率容易受到扩增模板的限制，使得后期扩增由指数增长转变为线性增长。
(3)NEAR恒温扩增技术的特异性和灵敏度取决于分子信标引物和切口酶。分子信标引物设计难度大，且Nicking酶等恒温扩增酶普遍比传统实时荧光PCR酶价格昂贵，因此NEAR恒温扩增技术在检测成本和应用范围上均逊色于qPCR 。
