干货信息：生物素（B）和亲和素（A）放大ELISA原理、步骤和注意事项！
一、原理
BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素（B）和亲和素（A）之间的高扩增效应而建立的检测系统。亲和素是从卵清蛋白中提取的碱性糖蛋白，分子量为68 kDa，由4个亚基组成，与生物素具有极高的亲和力（结合常数高达1015M-1）。生物素很容易与蛋白质（如抗体等）共价结合。这样，与酶结合的亲和素分子与与特异性抗体结合的生物素分子发生反应，不仅起到多级放大作用，而且当遇到相应的酶时，由于酶的催化作用而显色。底物，实现检测。抗原（或抗体）分子的用途尚不清楚。
2. 材料和仪器
抗体
血清亲和素
塑料板、检测器、注射器、滴管、毛巾、洗瓶、烧杯、玻璃棒、试管、吸管、量筒、冰箱、培养箱
3. 步骤
1) BA-ELISA检测未知抗原
1. 包被抗体
用0.05 M pH9.6碳酸盐缓冲液适当稀释已知抗体，在每个聚苯乙烯酶板的反应孔中加入0.1 ml，4℃孵育。°C过夜（18-24小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3分钟（简称洗涤，下同）。
2. 添加样品
将待测样品（未知抗原）或适当稀释的标准对照品加入反应孔中，同时制作空白孔、阴性对照孔和阳性对照孔。37岁孵化°C 1小时并洗涤。
3. 添加B抗体
每孔加入0.1 ml适当稀释的生物素化抗体（B-Ab），并在37℃孵育°C 30至60分钟。洗涤。
4.添加A-HRP
每孔中加入 0.1 ml 适当稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素 (A-HRP)，并在 37 ℃ 下孵育°C 30至45分钟。洗4次。”
5. 基材显色
将临时配制的TMB（或OPD）底物应用液0.1ml加入上述各反应孔中，37℃孵育。°C 10至30分钟。添加 0.05 ml 2 M H2SO4 以终止反应。
六、结果判断
目视或在 ELISA 比色计上测量 OD 值。
2. 检测未知抗体的 BA-ELISA 程序
1. 包被抗原
用0.05 M pH9.6碳酸盐缓冲液适当稀释已知抗原，加入0.1 ml至聚苯乙烯酶板孔中，4℃孵育。°C保持18-24小时。用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3分钟。
2. 添加样品
将适当稀释的待测样品（未知抗体）加入反应孔中，同时制作空白孔、阴性对照孔和阳性对照孔。37岁孵化°C 1小时并洗涤。”
3. 添加 B-Ab2
添加稀释的生物素化抗抗体（抗人或小鼠 IgG），每孔 0.1 ml，37 ℃孵育°C 30-60分钟，然后洗涤。
4. 其余步骤与检测未知抗原的BA-ELISA相同。
4、注意事项
1.反应物的浓度和比例
由于该方法灵敏度高，并且比ELISA方法使用较少的抗原或抗体，因此应严格控制生物素标记抗体（或二抗）的浓度。增加抗体浓度可以提高灵敏度，但太大则非特异性增加。
2. 生物素的稳定性
生物素标记抗体偶联物的稳定性优于酶标抗体，应长期保存。添加等量的60%甘油在-20℃下可保存2年左右°C、贮存过程中避免反复冻融，反复冻融会损害制剂的活性。
3. 亲和素的稳定性
亲和素在正常条件下稳定，能耐受热和多种蛋白质。然而，它对光敏感，在某些金属离子存在下很容易失活。因此，配制亲和素溶液时建议使用去离子水，并保存于4℃。°C 2个月或-30°C 半年。反复冻融后其活性保持不变。
4. 亲和素的非特异性吸附
亲和素在中性pH环境下带正电，可以通过静电相互作用非特异性吸附到固相载体上，这是测试中出现非特异性显色的主要原因。若提高亲和素稀释液的pH和离子强度，可显着降低亲和素的非特异性吸附，对特异性显色影响不大。亲和素还可以用戊二醛或乙酸酐进行化学修饰，使其乙酰化，减少其非特异性吸附。
5、反应物的作用时间和温度
由于抗生物素蛋白和生物素之间的高亲和力，两种标记物的反应时间比抗原抗体反应时间短得多。为了减少非特异性吸附，反应时间不宜过长，一般37℃时20-30分钟°C。
密封于干燥器内（内有干燥剂），放入0-4度冰箱保存。储存液体时应注意以下几点：
1）。样品不应太稀。必须浓缩到一定浓度后才能包装和储存。如果样品太稀，很容易造成氧化。2）一般需要添加防腐剂和稳定剂。常用的防腐剂包括甲苯、苯甲酸、氯仿和百里酚。等待。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等。对于酶来说，还可以添加底物和辅酶，以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定的保护作用。核酸大分子通常储存在含有氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。
3）储存温度要求低，大部分储存在0度左右的冰箱中，也有的要求更低的温度，具体取决于不同的物质。
