影响免疫分析标准曲线建立的因素！

经验分享：影响免疫分析标准曲线建立的因素！

   在实际工作实践中，标准曲线的制备非常重要。它会对整批实验的结果产生重大影响。放射免疫测定中，根据标准曲线计算受试物的浓度。标准曲线的准确性直接影响测定结果的准确性。然而，如何通过基于几个离散点建立的标准曲线来准确反映B/B0%与样品抗原浓度之间的真实函数关系，需要尽可能地从实验中进行检验，因此标准制定的每一步曲线步骤必须严格、精确。下面我们就放射免疫分析中标准曲线制作的影响因素进行分析。供同行参考。

1. 试剂成分

（1）标准品 标准品的活性、免疫反应性和纯度往往影响放射免疫分析的正确性，从而极大地影响结果。

标准品的活性要求与免疫反应活性和被测物质一致，并且必须是同源体系。稳定性好，易于保存，不含交叉反应物质和干扰免疫反应的物质，定量准确，与国际标准产品一致。所谓标准品纯度不是指化学纯度，可能含有杂质，但不应含有干扰放射免疫分析的物质

(2)蛋白质

在标准品与特异性抗体的平衡反应过程中，蛋白质具有抑制作用。若受试物以血浆或血清形式使用，则应在标准品中加入等量的蛋白质，以免蛋白质对受试物和标准品产生干扰。持续的。

(3)PH值和离子强度

抗原抗体反应在酸性或碱性环境中解离，因此反应应在接近中性或微碱性的环境中进行。其pH值优选为7.4-7.8，离子强度为0.05-0.1mol/L。必须具有缓冲能力（离子强度不能太小），但离子强度太高会妨碍抗原抗体反应。

(4)反应体积、温度和时间

减少反应体积可以减少抗体和标记抗原的绝对量，从而增强未标记抗原的竞争力，提高灵敏度，减少反映试剂的消耗。另一方面，由于小体积中形成的复合物的绝对量相应减少，放射性测量误差增大，而且由于样品体积变小，也容易造成操作误差。一般先用0.3-1.2ml反应体积。

抗原抗体反应需要一定的时间才能达到动态平衡。同时，它还受到温度的影响。反应温度每升高10℃（不超过37℃），抗原抗体结合达到平衡的速度就会增加一倍，但温度的升高会使抗原抗体反应减慢。亲和力降低；当温度过高(60℃)时，抗原和抗体会失活。

通常，待测样品的含量较高，抗血清的亲和常数较大，因此可选择较高的温度（37℃），较短的孵育时间。

但该复合物的结合牢度较差；如果分析物含量较低，抗血清的亲和常数K较小，则应在4℃下孵育较长时间，复合物的结合牢度较高。不容易解散。因此，放射免疫分析室应配备有空调的环境，低温离心机的温度应控制在15℃，以保证反应产生的沉淀不易解离。

(5) 肽酶、补体

某些物质如TRI-I、胰高血糖素等生物制品可被肽酶降解，因此测定缓冲液中应添加一定量的抑肽酶以抑制肽类激素的分解。另外，以肽激素为标准时，蛋白质激素补体可影响抗原抗体反应。

(6) 抗血清

抗血清的质量直接影响标准曲线的建立。其主要质量指标应具有高效价、高亲和力、高特异性，非特异性交叉反应率小。抗血清的稀释度要适当。如果稀释度太大，剂量反应曲线将右移。在RIA分析中，抗体的稀释度应尽可能大，并且应具有较高的灵敏度。

(7)其他

试剂盒必须在有效期内使用，不同批号的试剂不能混合。试剂盒从冰箱中取出后，使用前应平衡至室温。所有试剂，尤其是分离剂，在加入样品前必须颠倒充分混合。所有冻干产品在复水 10-15 分钟后即可使用。

2、添加样本的流程

（一）人员情况

操作人员上岗前必须接受基础理论和基本操作技术的培训，包括通过加样一致性评价。不遵守操作规则造成的误差，因为操作精度随着检查管数的增加而下降，所以每人每天操作不超过500管为宜。

(2) 试管

质地均匀，表面光洁度好，非特异性吸收低，不含放射性核素，使放射性的自吸收和几何位置很容易保持一致。

(3) 添加样本

样品添加量应尽可能准确（特别是添加标记抗原时）。经过长时间的使用，采样器弹簧的弹性和密封性会下降，从而影响其准确性。采样器应经常校准。为了减少误差，添加标准品和样品时应使用同一进样器，并避免添加标记抗原和抗血清时因管壁与移液器吸头的粘附而相互污染。同时应使用一次性吸引装置。标本、碘标记物和抗体的添加顺序不能任意颠倒。加样的倾斜角度应相同，并根据需要选择正向或反向加样。

（4）每批试验必须同时建立标准曲线。不建议使用标准曲线。如果使用之前制作的标准曲线，整批的测量结果会偏高或偏低。特殊情况下，如确需调用标准曲线，可采用药盒内附的质控品和患者正常标本进行严格质控。另外，每个浓度标准品应设置2-3个多管，样品应设置多管（切割），这是减少误差的重要保证。

3、测量仪器

必须使用效率高、本底低、稳定性好的放射性测量仪器，并使用足够的测量时间。辐射计数器应经常维护和保养。测量时，试管上部内、外壁应干燥，防止污染探头。选择检测器的最佳工作条件可以做出更好的标准曲线，从而获得可靠的测量结果。选择工况的方法通常包括平台曲线的确定或品质因数的确定。

(1) 平台曲线的测定

探测器的光电倍增管必须工作在一定的高电压状态下。该高电压应选择为在电压轻微波动时对计数率影响较小的高电压值。高电压值的选择由平台曲线决定。，从多次测量的结果中，选择平稳段较长、斜率较小的曲线，取曲线平稳段前1/3对应的高电压作为工作电压。

(2)品质因素的确定

当样品用于相对计数测量时，期望获得高的样品计数率和低的背景计数率，样品计数率与背景计数率的关系为：品质因数（F）=E2/ nb（E为测量效率，IIb为背景计数率）F越高，在此测量条件下，可以获得更高的样本计数率和更低的背景计数率。应用平台曲线测定和品质因数测定，后者考虑的因素更多，结果更可靠。

4. 曲线拟合模式

需要强调的是，曲线的拟合只是对标准品及其相应反应参数确定的曲线段进行数学处理。在标准产品给定的范围内，拟合的函数关系应保证其单调性，曲线拟合不能外推。同时需要注意的是，无论采用什么方法进行拟合，都不可能将不好的结果变成好的结果。只有保持实验封闭，才能真正提高实验结果的准确性。