胶体金发展的影响因素
1、耗材的选择
1.1 不同类型膜的筛选
硝化纤维膜的类型在测试中非常重要，反应载体影响整个测试的成败。不同厂家在硝化纤维素膜生产中使用的聚合物和表面活性剂的来源、种类和用量有较大差异，对所生产膜的性能影响很大—膜的孔径和分布结构不同。膜孔径减小，膜的实际可用表面积增加，膜结合蛋白的量也增加；膜孔径越小，层析速度越慢，金标复合物通过T线的时间越长，反应越充分；因此，膜孔径越小，灵敏度越高，但同时也减慢了运行速度，增加了非特异性结合的机会，即假阳性越高。用于金标准免疫测定的膜大多是硝化纤维素膜或硝化纤维素/醋酸纤维素混合膜。不同的涂层蛋白对膜有特定的要求。测试人员应根据蛋白质的性质选择合适的孔径和分布。根据膜的结构，找到合适的平衡点，使膜上的胶体金标记物的流速最佳。
1.2 绑定垫的选择
结合垫位于色谱系统的中间。一般要求结合垫的网格均匀，非特异性吸附低，以便能够很好地负载胶体金标记物和待检测样品而不被吸附；玻璃纤维素膜具有以上优点，同时具有一定的硬度，在实验中常用。
1.3 样品垫和吸水纸的选择
样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端，对于胶体金免疫层析系统功能的实现起着决定性的作用。检测时，应根据试纸条所检测样品的性质，选择合适的样品垫和吸水纸，保证样品在样品垫形成的通道中快速流动，不发生非特异性吸附或改变性质。样品的特性。如果检测样品是血清，可以选择网孔较松的玻璃纤维素膜；如果测试样品是有毒的，可以选择质量好的吸水纸和样品垫。吸水纸必须具有良好的储水能力，以保证样品所用液体通过膜的反应区并被样品垫吸收和积累。
2. 关于胶体金的制备
在金标免疫快速检测中，制备颗粒均匀、分散良好的胶体金非常关键。如果金粒径的变化范围太大，会影响测试的稳定性和重复性。如果金颗粒形状不规则或直径不均匀，则胶体金标记物容易解离、沉淀，导致金标扩散不完全，反应区背景颜色过深，出现假阳性现象；而胶体金的质量不好，胶体金结合物不能快速、完全地从玻璃纤维上解离，从而影响测试结果。
胶体金的制备不仅保证了药品的质量，而且制备过程中的细节关系到胶体金制备的成败。首先是操作环境和使用容器的清洁度。所有进入溶胶的污垢都会干扰胶体金颗粒的生成或导致生成的胶体金堆积。容器最好经过酸洗和硅化处理。操作环境应保持清洁、无尘，最好有专门的工作区域。其次，配制溶液需要用双蒸水或三蒸去离子水配制，烧制胶体金最好使用去离子水。另外就是不同还原剂对胶体金质量的影响。胶体金的制备是基于还原法。通过改变还原剂的性质和浓度，可以制备不同粒径的胶体金悬浮液。根据试验目的选择胶体金的粒径，并根据所选粒径确定还原剂，如配制直径5～12nm的胶体金溶液，用白磷或白磷还原氯金酸抗坏血酸; 胶体金使用柠檬酸三钠来还原氯金酸。另外，不同的烧成方法、制备的胶体金的量、还原剂的添加方式、加热容器的大小以及加热时间等也会影响胶体金颗粒的大小和均匀性。根据所需胶体金的粒径和数量，结合自身的试验条件，选择合适的胶体金制备方法。
3.标记蛋白及相关抗原抗体的制备
标记蛋白、T线、C线的抗原或抗体的纯度和浓度直接影响金标探针的质量。获得高纯度、中等浓度的抗原和抗体的关键在于制备和纯化方法的选择以及条件的优化。试验前应采用高速离心除去杂质，并采用饱和硫酸铵沉淀、亲和层析、透析等一系列处理方法，尽可能除去高浓度杂质和过量。单克隆抗体、二抗和相关蛋白溶液。离子，以免干扰目标蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金颗粒聚集；尤其是硼酸盐和磷酸盐不利于胶体金与蛋白质的结合，应尽量避免。同时，对各种大分子蛋白质进行充分处理，使其分散成单体并具有合适的分子量，提高胶体金与蛋白质的结合比例，有利于与胶体金充分稳定的结合。
4. 胶体金标记
胶体金标记的两个关键环节是标记的pH值和最佳蛋白标记量的确定。根据胶体金标记原理，只有当pH值接近或略高于蛋白质的等电点时，胶体金蛋白质的吸附力最强；pH值过高或过低都不利于两者结合，因此贴标时应选择精确的pH值。使用不同的方法反复校准pH测量仪器或试纸，并进行梯度测试以找到最佳的标记pH值。溶胶与待标记蛋白质的比例是否合适是影响标记成功的重要因素。蛋白质标记过多会造成试纸的浪费和拖累；蛋白质标记太少会导致胶体金标记不完全，从而降低试纸的灵敏度并出现假阳性。试验中还需要进行梯度试验，在破坏试验中反复比较不同标记量的标记物的稳定性，确定最佳标记量。
5. 膜包衣条件的优化
膜包被条件，包括封膜、环境湿度、T线和C线抗原或抗体浓度、点样膜条件、温度、包被时间等，需要根据实验实际情况反复调整。涂装过程中应特别注意以下两点：①膜上T线和C线抗原或抗体的包被量应相对饱和；②涂膜必须在合适的温度下彻底干燥，否则会造成拖尾，显色不清晰，灵敏度也受到很大影响。
5.1 所用膜的密封和处理
尤其是密封是一个非常有争议的问题。理论上来说，购买的膜基本都是经过优化处理的，可以直接在膜上使用。如果在贴膜前将膜浸泡在封孔液中进行封孔处理，势必会扰乱膜内正常的物质分布，从而带来许多不必要的麻烦。但在实际实验操作中，如果在未封闭的膜上出现非特异性条带或拖拉现象，或者在未封闭膜的情况下蛋白质或抗体无法包被在膜上的问题，则应考虑封闭。问题。建议在试纸条制作过程中根据各自标记物的性质以及在膜上的显色情况选择是否封闭。如果打标效果较好，膜上显色清晰，不拖尾，不误报，则完全不需要封膜。反之，可对膜进行密封，找出出现不良现象的原因。用于封膜的物质有多种，多采用牛血清白蛋白（BSA）、聚乙二醇（PEGMW20000）等大分子蛋白。常用的密封方式有流动密封和膜上定点密封。前者对样品垫上的密封材料进行处理，后者将活性物质喷射到膜的特定位置上的溶液中。
5.2 环境湿度
环境湿度对于点膜工艺非常重要。最佳湿度一般为45%至65%。湿度过低，薄膜上容易积聚静电荷，薄膜上容易出现分散斑点，导致测试时出现疏水斑点；湿度过高，薄膜上的毛细管作用加强，薄膜易造成T线、C线变宽甚至散开。为了保证加样时膜湿度的均匀性，加样前一般将膜置于湿度条件下一段时间。
5.3 T线和C线抗原或抗体的浓度
T线和C线上抗原或抗体的包被浓度直接影响抗原或抗体与金标的结合比例，最终影响试纸条的显色。包被浓度过低，膜上条带颜色不清晰或出现空心；如果涂布浓度太高，C线不会显色或出现拖曳现象。为了获得反应稳定、显色清晰的试纸条，需要调整比较两条线上抗原或抗体的结合浓度以及两者与金标的结合比例，以获得最佳组合。
5.4 点样位置
不同的T线和C线采样位置会带来不同的灵敏度。当采样位置向上移动时，金标复合物在通过T线位置时速度会减慢，反应时间会增加，灵敏度会增加；否则，灵敏度会降低。这种方法可用于改变灵敏度并消除误报。
5.5 点样仪
目前有两种点样方法，薄膜划片和非接触点膜。非接触膜式比刮膜式好。划膜型需要用软管将抗体划到膜表面，但膜本身的物理性质比较软且脆，划破的管子会在表面留下痕迹。划痕易对色谱金标络合物形成耐药性，造成假阳性。同时，跑板时T线位置处容易出现细线，影响结果的判断。样品点样仪不仅可以控制T线、C线的点样位置，还可以通过点样仪各种参数的调节来控制T线、C线的宽度、喷膜速度等细节，实现最佳的显色效果。测试过程中需要反复调整各种参数进行对比测试，观察试纸条的显色情况来确定。
6. 缓冲器
缓冲液构成了胶体金免疫层析技术的液相载体，在不影响胶体金与蛋白质、抗原与抗体、硝酸纤维素膜与T线、C线蛋白质的结合的情况下，为它们提供最佳的结合反应。良好的酸碱环境。缓冲液不是通用的，不同的反应体系需要不同的缓冲液来支持，这就需要实验者结合自己的实验尝试不同的缓冲液，以确定适合自己的缓冲液配方。常用的缓冲体系是在选定的缓冲溶液（磷酸盐、硼酸盐等）中添加相应的活性物质而配制而成。所谓活性物质是为了解决反应体系中的特定问题而添加的相应物质。例如，在缓冲液中加入适量的表面活性剂，可以增加亲水性，增强色彩，避免线条的空心现象；还可以同时添加多种物质，通过它们的相互协同作用解决相关问题。例如，少量的NaCl可以降低信号强度并消除假阳性；糖和聚乙二醇可以作为保护剂，可以减缓老化速度，增加亲水性，但活性物质的添加要简单，不宜复杂。试纸条制备过程中的许多处理液是在所选缓冲液的基础上添加相应的活性物质来配制的（如封闭液、结合垫处理液等）。
7. 样品处理及结果判断
7.1 样品处理方法及样品量
对于临床标本（如全血、血清、血浆），不同单位和检测人员采用的处理方法并不统一，也会影响结果的判断。例如，血浆中大量的纤维蛋白原影响层析的速度和均匀性，直接影响抗原和抗体的结合，如果处理不当甚至会出现非特异性结合。测试时，样品添加量应相对充足，使膜上的反应能够充分进行，从而得到清晰的结果。如果样品添加量过少，会导致试纸条上样品色谱不充分，出现假阴性。
7.2 结果判断
由于使用胶体金产品的工作人员分布在不同层级、不同部门，因此判断结果存在很大的随意性，判断时间也不统一，特别是受到工作环境、温度、湿度的影响，据介绍标线显色时间可以任意判断，忽略厂家设定的有效时间。因此，在检测过程中，要求工作人员能够及时区分检测结果中的假阳性、假阴性和异常条带，找到原因后重新检测或结合检测结果进行重新检测比对确认。相关检测方法，避免漏检和误报。
8. 产品的储存和验证
8.1 产品储存
新生产的测试条或测试卡一般含有5%~10%的水分，储存时的环境过于干燥和过于潮湿都不利于产品储存。如果环境过于干燥，薄膜上的水分蒸发，使薄膜疏水、带电、变脆；环境过于潮湿影响金标质量及T线、C线的着色效果；因此，成品试纸条和检测卡应设计成防潮的。如果长期保存，一般需要避光、密封保存。环境温度也会影响标志物、抗原、抗体的生物活性，低温条件下可有效延长产品的保存时间。
8.2 成品验证试验
验证测试包括特异性测试、线性灵敏度测试、稳定性测试、样品检测、干扰测试、批间和批内重复性测试等10项测试，全面评价产品的质量。成品验证测试需要较长时间，特别是产品的稳定性测试需要长期定期取样。结合自己的试验，参考相应的国家或行业标准，制定有针对性的试验，检测成品的特异性、稳定性、重复性和灵敏度，以便进一步优化，最终做出高质量的试纸条或。测试卡提供数据支持。
综上所述，胶体金免疫层析技术的各个环节都受到多种因素的影响，这也使得免疫胶体金技术建立的检测方法在实际应用过程中也存在一些问题，如胶体溶液的稳定性差、保存时间长等。免疫胶体金技术的检测周期相对较短，且灵敏度受多种因素影响，导致其应用存在一定的局限性。随着科学技术的进步，这些问题将在未来的研究中逐步得到改善，免疫胶体金技术将进一步展现其巨大优势，实现半定量或定量检测和多样化检测，并拓宽其在光镜、电镜等领域的应用范围。 、流式细胞术、蛋白质印迹、生物芯片等领域。
