MLPA简介
MLPA是“多重连接依赖性探针扩增”的缩写，是一种对待测核酸中的靶序列进行定性和定量分析的高通量技术。基本原理是用简单的探针与目标序列DNA杂交，然后进行连接、PCR扩增、毛细管电泳分离产物和数据收集，并通过分析软件对收集到的数据进行分析并得出结论。它可以同时检测多达50个核苷酸序列的拷贝数变异，并且可以检测小于60bp的片段。它可用于检测一些与疾病相关的基因或染色体的缺失或扩增。
MLPA方法的历史可以追溯到2002年，当时荷兰学者Schouten博士提出了这种多重连接依赖性探针扩增技术。他在论文中描述了该方法的原理和应用。MLPA方法由MRC-Holland开发并商业化，提供多种MLPA试剂盒和分析软件。自推出以来，MLPA方法受到许多实验室的欢迎，因为MLPA法还用于检测某些与疾病相关的基因或染色体的缺失或扩增，如遗传性乳腺癌、结肠癌、遗传性胃癌、神经母细胞瘤等
MLPA主要用于检测DNA中的拷贝数变异（CNV），即染色体上大于1kb（有文献建议大于50bp）的DNA片段的增加或减少，主要表现为缺失和重复的形式。亚微观水平。CNV 可能由基因组重排（例如染色体缺失、重复、插入和易位）或非等位基因重组（同源序列之间的错配和交换）引起。CNV 可以影响基因表达和功能，并与许多遗传疾病和癌症相关。MLPA 的作用通过使用一对特异性探针来识别目标DNA序列。然后用连接酶连接相邻的探针，形成可通过 PCR 扩增的分子。每个探针对的长度不同，因此可以通过电泳分离PCR产物并通过荧光检测。通过比较样品和参考样品的峰模式，可以计算出样品DNA中目标序列的相对量。MLPA可用于检测与遗传性乳腺癌、结肠癌、杜氏肌营养不良症等疾病相关的CNV MLPA还可用于检测肿瘤中的CNV，以优化肿瘤分期。
-步骤1：探针和靶序列DNA的杂交。将样品DNA与特异性探针混合，加入杂交缓冲液，在恒温器或水浴中进行杂交反应，使探针与目标序列DNA完全互补。
-步骤2：探针的连接。将杂交反应体系转移至新的PCR管中，加入连接缓冲液和连接酶，置于恒温器或水浴中进行连接反应，使相邻的探针连接成可被PCR扩增的单分子。
-步骤 3：探针放大。将连接反应体系转移至新的PCR管中，加入PCR缓冲液、dNTP、通用引物和PCR酶，置于PCR仪中进行扩增反应，使连接的探针分子呈指数扩增。
-步骤4：扩增产物的电泳分析。将扩增反应体系与分子量内标和甲酰胺混合，置于毛细管电泳仪中进行电泳分离和荧光检测，获得不同长度探针分子的峰图。
-第五步：数据分析和结果解释。使用专业软件对电泳数据进行峰检测、归一化、质量控制和结果评价，以确定样本DNA是否存在拷贝数变异。
-探针的长度应在40-70个核苷酸之间，优选在50-60个核苷酸之间。
- 探头的Tm值应在55-65之间
°C，最好在60左右°C、两个探针的Tm值相差不应超过5°C。-探针的GC含量应在30-70%之间，优选在40-60%之间，并且两个探针的GC含量应相差不超过10%。
探针末端应避免出现-G或C，以防止形成二级结构或非特异性杂交。
-探针应避免重复、同源或互补序列的存在，以防止二级结构或非特异性杂交的形成。
-探针应避免SNP位点的存在，以防止影响杂交效率或特异性。
-样品质量：样品DNA的质量和数量对MLPA反应的结果影响很大，因此需要使用合适的DNA提取方法，避免DNA降解和污染，使用纯化水或TE缓冲液稀释DNA，并使用纳米光谱法或荧光法测定 DNA 浓度。
-反应条件： 反应条件的优化对于MLPA反应的效率和特异性也很重要，因此需要按照试剂盒说明书准确配制反应体系，避免引物二聚和非特异性扩增，使用恒温器或水浴进行杂交和连接反应，并使用高保真（或称为长片段）PCR酶进行扩增反应。
-电泳分析：电泳分析的质量控制主要包括荧光校准、分子量内标、峰检测和归一化步骤，需要使用与探针标记相匹配的荧光校准标准品进行光谱校准，以准确检测引物上的染料标记。需要使用专门的（例如 Coffalyser）软件进行样品峰大小和注射误差校正（通常是 ROX）、峰检测和归一化，以消除样品之间的差异。
-结果评估：结果评估的质量控制包括对来自参考、QC 和测定样品的数据进行分析和解释，使用适当的（例如正常人）参考样品作为正常拷贝数（通常为 2）的基线，并使用 QC 样品作为对照（例如，合成的或已知的患者）对于已知的拷贝数变异（例如，1或3）。需要专业（例如Coffalyser）软件进行数据分析和结果解释（例如计算拷贝数比率和设置异常阈值）以确定测试样本中是否存在拷贝数变异。
-步骤 1：峰值检测。对电泳数据进行峰检测，以获得每个样品的每个探针的峰高或峰面积值。
-第2步：标准化。将每个样品的峰值进行归一化（通常通过除以下标峰值并乘以一个因子）以消除样品之间的差异（例如，进样量、PCR效率等），以获得每个样品的每个探针的归一化值。
-第3步：质量控制。评估每个样品的质量（例如，计算 CV 值），检查异常（例如，缺失、减少或增加）或低信噪比 (SNR)，并排除未通过的样品或探针（例如，低于 0.85 或高于 1.15）。
-第4步：结果评估。比较每个样本的每个探针的归一化值（通常是除以参考样本平均值并乘以2），并计算每个样本的每个探针的拷贝数比（ratio），以确定是否存在拷贝数变异（例如，缺失、重复或正常）。
-步骤 5：结果解释。根据测试和试剂盒的目的，对每个样品的每个探针的拷贝数比率进行解释，并与参考和质量控制样品的数据相结合，得出最终结论和报告（例如，是否是微缺失综合征或其他存在遗传性疾病）。
-检测遗传性乳腺癌和卵巢癌 MLPA 方法可以检测与遗传性乳腺癌和卵巢癌的发展相关的 BRCA1 和 BRCA2 基因的拷贝数变化，例如缺失或重复。
MLPA 方法可检测 MSH2、MLH1、PMS2 和 MSH6 基因中的拷贝数变化，例如缺失或重复，这些变化与遗传性非息肉病性结肠癌 (HNPCC) 的发展相关。
-MLPA方法可以检测MYCN基因的拷贝数变化，例如扩增或正常，这与神经母细胞瘤的预后和分级相关。
-MLPA方法可以检测21号染色体上多个基因或片段的拷贝数变化，例如三体性或正常，这与唐氏综合症的诊断相关。
MLPA方法检测特定基因或位点的DNA甲基化状态，例如甲基化或非甲基化，这与基因表达和表观遗传学的调节相关。
