IVD研究犬教您如何优化ELISA！
1、固相载体的选择
载体的种类很多，有纤维素、交联葡聚糖、葡萄球菌聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。使用形式有凹板、试管、珠子等。
聚苯乙烯凹孔板是应用最广泛的载体。聚苯乙烯塑料微量滴定板具有良好的蛋白质吸附性能，操作方便，用量小，适合大规模检测。
由于聚苯乙烯工艺不够稳定，批次间差异较大。因此，在进行 ELISA 之前必须进行筛查。检验方法：
∶检查吸附性能：先加入抗体包被，再加入相同稀释度的酶标抗体，最后加入底物，显色，测定OD值，计算总体平均OD值，然后计算每两个的OD值相邻的井。OD平均值，该平均值在合格范围内±总平均值的10%。如果中间孔与周围孔的OD值相差太大，或者一侧孔的OD值与另一侧孔的OD值不同，则认为不合格。
④对比测定阳性血清和阴性血清，观察是否有明显差异。若两者OD值相差10倍以上即为合格。
板处理。新板一般不需要处理，用蒸馏水冲洗后即可使用。该板在使用一次后即被丢弃。但不少实验工作者认为，超声处理清洗液Tritonx100和20%乙二醇仍然可以使用。但如果发现空白对照颜色较深，阳性样品显色结果不理想，则应丢弃。
2. 载体的吸附条件
载体的吸附均为物理吸附。吸附量取决于pH值、温度、蛋白质浓度、离子强度和吸附时间。
较好的吸附条件为：离子强度0.05Mol/L~0.10Mol/L，pH9.0~pH9.6碳酸盐缓冲液，蛋白浓度1μg/ml~100μg/ml，4℃过夜或37℃ � 3 小时。
3. 所用酶标抗体浓度的测定
在聚苯乙烯板孔中加入足量抗体包被，孵育一定时间，冲洗并稀释酶标结合物。每个稀释度添加 2 个孔，孵育、冲洗并添加底物以显色。,比色。以 OD 值为纵坐标，酶标结合物稀释度为横坐标，绘制曲线。求OD值为1时酶标抗体的最佳稀释度。
该稀释度是指该条件下的最佳稀释度。在其他条件下这不会是最佳的。例如，酶标抗体以 1:400 稀释度孵育 6 小时可产生与以 1:6,400 稀释度孵育 24 小时相同的结果。因此，条件一旦确定，请勿更改，以保证结果的重复性和相对准确性。
此最佳酶标抗体稀释度可作为工作浓度，也可增加一半至一滴度，但不能增加太高，否则非特异性显色会增加。
酶标抗体的效价反映了酶标抗体的质量，也可以用来比较酶标偶联物的质量。有报道认为效价1：320为合格，效价1：1000以上为佳。酶标抗体效价越高，工作浓度使用的稀释倍数越大，灵敏度越高，非特异性反应越低。
4. 抗原：
∶� 抗原要求：
用于 ELISA 的抗原必须相当纯。如果含有其他杂质，它将与抗原竞争固相载体上的有限位置。用于其他血清学反应的抗原可能不适合 ELISA 实验，必须进行测试。抗原必须牢固吸附在载体上而不丧失其免疫活性，才能得到规律、重复的结果。另外，吸附载体后，各种添加试剂的非特异性吸附极小，即与阴性和阳性血清的结合存在较大差异。
∶� 抗原滴度测定：
可以使用单方阵或双方阵测试。①单阵列检测：将不同稀释度的抗原包被酶板，加入常规1:200倍稀释的阳性血清，然后加入酶标抗体，显色，测定OD值。当OD值为1.0时，以相应的抗原浓度作为效价；②双阵列测试更准确，可以同时测出抗原和抗体的最佳浓度。即将抗原和抗体稀释成不同浓度进行酶标抗体反应。最高稀释倍数的阴性和阳性血清吸光值差异最大对应的抗原稀释倍数即为该抗原的效价。
吸附抗原的固相载体在冷冻干燥或干燥后非常稳定，几个月内也不会失去活性。
5、清洗液
一般使用0.01Mol/L pH 7.2 PBS Tween缓冲液。吐温是聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，是一种非离子表面张力物质，常被用作助溶剂。吐温的数量取决于与聚合山梨糖醇结合的脂肪酸的类型。吐温20与月桂酸结合，吐温40与棕榈酸结合，吐温60与硬脂酸结合，吐温80与油酸结合等。吐温20通常作为润湿剂添加到缓冲液中以减少非特异性吸附。也可以在PBS缓冲液中加入1%牛血清白蛋白（或10%小牛血清或卵清蛋白），特别是包被抗原后，再用牛血清白蛋白缓冲液包被以占据孔内。保留剩余位置以减少非特异性反应。
6、反应时间
抗原与抗体、抗体与酶标抗体之间的反应一般在37℃时达到高峰°C 2至3小时。时间太短，灵敏度会下降；如果时间太长，吸附的抗原或复合物（在此温度下）可能会脱落。
7. 抗体
抗体滴度的测定与抗原滴度的测定相同，采用双阵列测试。
酶底物测定反应时间：一般采用15min~30min~45min。也可将标准阳性血清作为标准品，随时测定其OD值。当达到规定的OD值时，反应终止。
