IVD研究犬，你会选择发光磁珠吗？
化学发光免疫分析 (CLIA) 以其高灵敏度而闻名，可以检测低浓度的分析物，并在较宽的动态范围内提供良好的检测限。免疫磁珠（IMB）具有操作简单、分离效率高、比表面积大、物理稳定性好等优点。是一种性能优异的磁分离载体，是复杂分析物纯化、检测和定量分析的通用工具。作为固相载体，磁珠与 CLIA 结合。在外部磁场的作用下，它们可以快速地与底物液相分离。磁珠由于其高效的分离和富集作用，在免疫分析反应中将抗原固定在磁珠上。抗体的作用显着降低。
磁珠作为免疫反应和信号采集载体的优势：
1）磁珠比表面积大，可以结合更多的蛋白质分子，可以提高检测范围。
2）磁珠表面的化学基团与蛋白质形成共价偶联，比物理吸附更强、更稳定。
3）磁珠均匀悬浮在反应液中，大大增加了与样品中分析物的接触面积，减少了反应所需的样品体积，同时更快地达到反应的动态平衡，速度提高反应速度，节省反应时间。
4）连接多种捕获蛋白的磁珠与多重标记技术相结合，可实现同一样品中多种分析物的同时检测，实现自动化个体化检测。
一、磁珠的种类和结构
1.1 常见磁珠类型
1）羧基磁珠（Carboxyl Mag）
羧基羧基磁珠是化学发光试剂用高性能磁珠。羧基官能团用于蛋白质或核酸偶联。它们可以在酶联免疫分析、免疫沉淀和蛋白质印迹分析中发挥出色的性能。
2）Tosyl磁珠（Tosyl Mag）
由于磁珠涂层含有甲苯磺酰基，含有氨基的抗体等分子可以通过化学结合直接固定在磁珠表面，无需羧化剂。
3) 链霉亲和素磁珠（Streptavidin Mag）
与链霉亲和素偶联的磁珠可以特异性吸附高纯度的生物素标记分子，磁珠表面的亲水性聚合物涂层不会影响酶促反应和PCR核酸扩增。
1.2 结构
磁珠结构一般由磁芯、聚合物涂层和功能基层组成。在外部磁场的作用下，磁珠在磁场中作定向运动，辅以微控制和检测手段，可实现磁珠定位和介质分离。
1）磁芯：主要由纯金属（如钴、镍、铁）或其氧化物等磁性材料组成。此外，还可以使用CoPt3、FeCo、FePt等磁性材料。
2）聚合物涂层：材料一般为聚苯乙烯和聚氯乙烯，主要用于稳定新形成的磁珠表面，防止磁珠聚集。聚合物涂层可与多种活性物质结合，如抗原、抗体、核酸等。
3）功能基础
蛋白质或抗体偶联磁珠表面的稳定性主要取决于表面性质。当磁珠表面未修饰时，抗体通过疏水作用被动吸附在磁珠表面。这种方法无法控制附着分子的最终方向，也无法保证捕获分子的特异性和稳定性。为了确保偶联稳定性和捕获特异性，可以选择化学修饰表面和生物修饰表面。
u 表面化学改性：
①经典化学改性表面：
抗原或抗体直接被动吸附在化学修饰的磁珠表面。活性基团利用磁珠的表面积为抗原或抗体共价附着到磁珠上提供大量位点。添加到表面的经典基团是羧基、氨基、羟基和硫酸根。
表1. 磁珠典型的化学修饰和活化方法
磁珠的化学修饰和活化：
羧基修饰
添加碳二亚胺 (EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 或磺基-NHS 和乙基（二甲氨基丙基）进行活化。
氨基修饰
激活蛋白质表面羧基。
羟基修饰
在非水溶液中活化以避免中间体水解。
②预活化改性表面：
分子附着在预活化修饰磁珠表面之前无需进行初始活化，在适当的缓冲液、pH和温度条件下即可形成稳定的共价偶联。
表 2. 磁珠的预激活修饰和结合基团
磁珠预激活修饰和结合基团：
甲苯磺酰基修饰
中性pH值：结合蛋白质的巯基；pH值呈碱性：结合氨基。
环氧基改性
弱碱性pH：与硫醇基团结合；较高的 pH 值：与氨基结合；强碱性pH：与含羟基配体结合。
氯甲基修饰
室温下 pH 值呈中性：与氨基结合。
生物改性表面（表面生物功能化）：
生物功能化磁珠由于其超顺磁性而被广泛用于捕获特定分子或细胞。生物修饰与化学修饰的不同之处在于它们以非共价键连接分子。在生物技术领域，生物功能化磁珠通常用于蛋白质/分子纯化等分离过程，以及作为体外诊断试剂中的固相载体。
①蛋白 A 或 G 以非常高的亲和力结合某些免疫球蛋白亚型。蛋白A与大多数Ig的Fc区结合，蛋白G与Ig的Fc或Fab区结合，可用于固定抗体；
②链霉亲和素具有非常高的亲和力，链霉亲和素与生物素的结合可以承受高温和宽范围的pH值等极端条件。
化学修饰：磁珠通过表面的-COOH、-NH2、-OH、-SH等化学修饰基团与抗体共价偶联
优点：表面改性简单、耦合稳定
缺点：容易聚集、非特异性结合
生物修饰：磁珠通过表面链霉亲和素、抗 IgG、蛋白 A 或 G 等生物修饰与抗体非共价偶联
优点：生物磁分离无需额外洗涤；可以承受高温等极端条件
缺点：昂贵
2. 免疫磁珠的原理及应用
2.1 原理
磁珠一般具有超顺磁性，可以在磁场作用下实现结合与非结合蛋白的快速分离，简化操作，缩短反应时间。磁珠表面通过外部修饰的官能团结合活性蛋白，作为抗原抗体反应的载体。磁珠的作用方式分为直接作用和间接作用。直接作用是利用抗体/抗原包被的磁珠直接与特定的抗原/抗体物质结合，形成磁珠-免疫复合物。间接作用是用二抗包被磁珠，将抗原与一抗孵育，然后加入偶联二抗的磁珠，形成磁珠-二抗-一抗-抗原复合物。该复合物具有较强的磁响应性，在磁力作用下定向运动，从而使复合物与液体中的其他物质分离，达到分离、浓缩、纯化特定蛋白质的目的。
2.2 应用
固定化抗原或抗体的免疫磁珠已广泛应用于免疫分析、细胞分离、生物大分子纯化、分子生物学等领域。免疫磁珠还可用于临床靶向给药、磁共振成像、细胞间热疗等对肿瘤进行靶向破坏。
1) 免疫分析
在免疫测定中，免疫磁珠用作固相载体。抗体和抗原在磁珠上特异性结合，形成抗原抗体复合物。在磁力的作用下，特定的抗原与其他物质分离。这种亚磁分离具有灵敏度高、检测速度快、特异性高、重复性好等优点。磁珠还可以检测表面分子并通过极性现象判断细胞类型，可用于激素、神经递质、细胞因子、肿瘤相关抗原等物质的检测。
2) 细胞分离
利用磁珠和抗体，在磁场作用下可以分离细胞，广泛应用于：
①体液中少量肿瘤细胞的检测，提高肿瘤的早期诊断率；
②快速有效分离T细胞和B细胞，用于器官移植中的HLA组织分型；
③骨髓移植预处理，提高移植成功率；
④为各种医疗和科研项目分离或去除特定的细胞成分。
3）生物纯化
磁珠可作为微型配体载体，将抗原或抗体固定在基质上，形成特异性吸附，然后进行磁力亲和提取，无需离心和过滤。可用于分离纯化大分子、DNA、RNA、DNA结合蛋白、mRNA等物质。
4）分子生物学应用
磁珠可以借助亲和素-生物素系统与非蛋白质结合，磁珠固相单链分离方法可以直接分离PCR双链产物或对其单链进行测序。
