分子：PCR 产物平端克隆指南！

我们先来看看原理：通过PCR扩增目的基因，对样品进行必要的纯化和回收后，平端连接克隆也是分子生物学实验中常用的常规技术路线。实验一般使用噬菌体T4 DNA聚合酶等，对扩增的DNA片段的末端进行填充（Weiner 1993；Chuang et al. 1995）。Liu和Schwartz(1992)发现，在连接反应的孵育过程中，反应液中过量限制性内切酶的存在可以显着提高重组质粒的产量。这种核酸内切酶可切割环状和线性多联体，并且该内部切割位点是通过质粒分子的自连接产生的。该方法要求将目标 DNA 分子与载体连接，消除其限制性位点。在此过程中，还需要防止核酸内切酶消化连接反应产生的重组体。在连接反应中，单位长度线性载体分子的连续产生（或再生）的净效应将驱动连接反应的平衡状态向有利于载体与插入片段连接产生的方向发展。重组体。

过程中使用的材料和仪器：噬菌体T4 DNA连接酶、噬菌体T4 DNA聚合酶、限制性内切酶、闭环质粒DNA、目的基因DNA、ATP、dNTP溶液、KGB广域缓冲液；琼脂糖凝胶、水浴盒

步骤是：

1、准备材料

1. 缓冲液和解决方案

10 毫摩尔/升 ATP

2 mmol/L dNTP 溶液（含有四种 dNTP）

10X KGB 广域缓冲液（1 mol/L 乙酸钾、250 mmol/L Tris-乙酸盐（pH 7.6）、100 mmol/L MgAc（含四水合物）、5 mmol/L β-巯基乙醇、100 μg/ ml 牛血清白蛋白）

2. 酶和缓冲液

噬菌体 T4 DNA 连接酶

噬菌体 T4 DNA 聚合酶

用于克隆的限制性核酸内切酶

限制性内切酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶

4. 核酸和寡核苷酸

闭环质粒 DNA (50 μg/ml)

目的基因DNA（25μg/ml）及PCR扩增产物

5、专用设备

水浴预设水温22℃

二、操作步骤及方法

1. 在微量离心管中依次加入以下试剂并混匀：

50μg/ml闭环质粒载体1μl

25μg/ml PCR扩增靶DNA 8μl

10X KGB广域缓冲器2μl

H2O 5μl

10 mmol/L ATP 1 μl

2 mmol/L dNTP 1 µl

限制性内切酶 2单位

T4 DNA聚合酶 1单位

T4 DNA 连接酶 3 单位

注：用H2O调整最终反应体积至20μl反应体系。

架设对照反应管，加入除目的DNA PCR扩增以外的所有试剂。

2. 将连接反应混合物的离心管置于22℃培养箱中孵育。°C水浴4小时。

3、从上述两个试管中取出5μl连接反应混合物样品，用10μl H2O稀释，转化为具有抗生素抗性的感受态大肠杆菌受体菌。将这种转化的细菌溶液涂在含有适当抗生素和含有 IPTG 和 X-gal 的培养基的平板上。

4. 计数培养皿上实验管和对照管之间的菌落数。

挑取可能含有目的基因DNA插入片段的白色单菌落进行培养扩增，提取质粒DNA，利用质粒多克隆位点中插入的外源DNA片段侧翼的酶切位点，用相应的限制性内切酶进行酶切。核酸酶消化及鉴定；菌落PCR也可用于鉴定。

5. 通过琼脂糖凝胶电泳确定克隆 DNA 片段的大小（使用适当的 DNA 标记分子量作为对照）。

6. 利用DNA序列分析、限制性内切酶图谱或Southern杂交进一步鉴定克隆的目的基因DNA片段的正确性。