CRISPR/Cas13a 液滴液体中的多重细菌检测
低水平细菌的高通量检测对于公共卫生、食品安全和第一反应至关重要。在本文中，我们首次提出了一种基于液滴微流体的平台，该平台具有重组酶辅助扩增（RAA）辅助的一锅法聚类规则间隔短回文重复序列和 CRISPR 相关蛋白 13a（CRISPR /Cas13a）分析和液滴编码准确、灵敏地测定各种食源性病原体核酸的策略。
该工作流程充分利用 CRISPR/Cas13a 信号放大和液滴限制效应来提高检测灵敏度并实现终点定量。同时，通过改变液滴的颜色，同时检测到的细菌数量大大增加。它能够同时检测七种不同类型的食源性病原体。值得注意的是，该系统也应用于实际食品样品，取得了满意的结果。总体而言，鉴于高灵敏度、出色的选择性和大规模多重检测的优势，基于CRISPR/Cas13a的一锅法液滴微流控系统可以扩展和推广用于其他细菌的鉴定。
基于一锅CRISPR/Cas13a的液滴微流系统综述
(A) 一锅 CRISPR/Cas13a 分析的概念。可以使用单步反应来检测细菌，其中 RAA 从目标 DNA 生成 dsDNA，然后将其翻译成 RNA，以一步激活基于 Cas13a 的荧光报告基因的切割。
(B) 编码液滴生成示意图。将不同目标引物的溶液与油和食用染料一起乳化成数千个编码液滴，并进一步混合以形成液滴库。
(C) 基于 CRISPR/Cas13a 的液滴微流控系统的工作流程。生成包含目标的液滴，并使用电极驱动来引发与编码液滴随机合并的响应。孵育后，对单层液滴阵列进行明亮的荧光成像，以识别和定量目标细菌。
一锅 CRISPR/Cas13a 检测的构建和优化
(A) 一锅 CRISPR/Cas13a 测定可行性的荧光分析。
(B) Cas13a 介导的切割的琼脂糖凝胶电泳分析。
(C) 特定测定的荧光结果的热图分析。优化
(D) FQ5U 报告浓度，
(E) 温度和 (F) 孵育时间。
液滴编解码示意图
(A) 液滴编码策略的构建过程。
(B) 具有 95% 置信区间的液滴的 RGB 颜色空间差异。
(C) 液滴生成芯片生成的液滴的图像和尺寸分布。
(D) 使用 Matlab 脚本收集和解码颜色编码的液滴。
(E) 颜色识别的误报和漏报百分比。
微电极模块的表征
(A) 通过将液体焊料注入微通道来制造微电极的过程。
(B) 触发和非触发合并条件下液滴的显微镜图像。
(C) 合并前后液滴尺寸分布分析。
(D) 调整电极电压以启动液滴合并。误差线代表合并直径的标准偏差
用于细菌检测的液滴微流体系统的评估
(A) 测量浓度 (Y) 和异常浓度 (X) 之间的线性关系。插入片段是使用 ST 的 DNA 浓度系列稀释液进行单锅 CRISPR/Cas13a 测定的微阵列的代表性荧光图像。
(B) 针对细菌的液滴微流体系统的特异性测试。（n = 3，误差线代表测量的 DNA 拷贝数的变化）。
(C) 热图显示通过数字一锅 CRISPR/Cas13a 和 qPCR 分析确定的穗状生菜中的 DNA 浓度。
(D) 数字化一锅法 CRISPR/Cas13a 检测 8 个食品样本的性能结果，与 qPCR 结果 100% 一致。
