NC膜吸附抗原抗体常见问题处理！
膜检测的开发人员应认真考虑影响蛋白质与硝酸纤维素膜结合的许多因素，包括原材料的固有特性和处理。随着胶体金标记技术的发展以及研发人员对胶体金快速检测技术的深入研究，市场上膜基快速免疫层析检测产品的种类迅速增多。
虽然免疫层析产品的包装设计有多种类型，但实际上，目前主流的商业检测试剂盒主要有以下两种形式。最常用的检测形式是侧流层析或定量色谱，通常在诊所或由直销客户进行。另一种检测形式是垂直点渗滤，它需要很强的操作员技能，并且仅限于研究用途。
无论使用何种测定形式，灵敏、可重复的测定的生产都需要试剂制造商采用有效的方法来制备测定线工作溶液。快速诊断制造商通常对有关如何优化其测试线的文章非常感兴趣。这些文章可以帮助研究人员将蛋白质固定化基础知识的讨论与硝酸纤维素膜联系起来，并强调研究人员在开发免疫层析试剂时面临的常见问题。由于NC膜上蛋白质吸附相关的问题在侧流层析中很常见，因此本文重点讨论这一方面。
在免疫色谱检测中，蛋白质被固定在 NC 膜上作为待测样品的捕获试剂。由于检测结果完全取决于捕获试剂在膜上良好的吸附效果，因此膜上蛋白质均匀且良好的吸附对于检测结果非常重要。
自从NC膜首次用于蛋白质吸附以来，关于NC膜上蛋白质吸附的研究已经相当多，但NC膜上蛋白质吸附的确切机制仍不清楚。尽管多种力在结合中发挥作用，例如疏水力、氢键和静电相互作用等，但每种力的重要性和精确影响仍然难以捉摸。目前有两种可行的行动模式。第一个模型认为，蛋白质最初通过静电相互作用吸附到NC膜表面，而长期结合是通过氢键和疏水相互作用完成的。尽管这个原理很难证明，但它与已发表文献的实验结论一致，是最被接受的作用机制。
第二个模型认为，蛋白质首先通过疏水相互作用与NC膜结合，然后通过静电力牢固地与NC膜结合。这种结合方式与大量已发表文献的结果是一致的。然而，静电相互作用机制无法为NC膜通过干燥或乙醇吸附方法长期稳定吸附蛋白质提供合理的解释。
无论蛋白质结合力如何平衡，研究人员在优化特定NC膜的蛋白质吸附时都必须综合考虑影响蛋白质吸附的所有力。这种观点不可避免地影响试纸条的选择及其加工工艺。例如，如果产品开发人员选择了大大减少静电或疏水相互作用的缓冲液，则蛋白质的吸附能力会大大降低。同样，蛋白质点样后充分干燥对于保证蛋白质在NC膜上的长期稳定固定也非常重要。
制造商选择的材料能够有效地将蛋白质吸附到NC膜上。影响NC膜上蛋白质吸附的材料一般有三类：非特异性蛋白质、影响静电相互作用的物质和疏水相互作用。常见的可以减少蛋白质结合的物质包括竞争蛋白质结合位点的其他蛋白质，如BSA、动物血清、干扰氢键形成的物质（如甲酰胺、尿素）、影响疏水相互作用形成的物质（例如 Tween、Triton、Brij）。聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等合成缀合物也能影响蛋白质结合，其作用机制可能是抑制一种或多种蛋白质与NC膜结合的综合作用的结果。
如果NC膜结合的蛋白量不足或者蛋白结合力不够强，就会出现相当多的问题，这些问题在检测结果的检测线上非常明显。与膜的距离太低，则结果中检测到的线条颜色较弱，检测灵敏度降低，如果蛋白质不能牢固地吸附在NC膜上，蛋白质在吸附之前就会发生扩散。 NC膜，导致检测线变宽，颜色变弱而不是明亮清晰，使得检测结果难以判读。在极端条件下，如果蛋白质对NC膜的物理吸附太弱，流动的蛋白质检测和表面活性剂溶液可能会将NC膜上的固定蛋白洗掉，导致显示范围变宽或不显示，测试线不清晰，难以解读测试结果。
体外诊断试剂的研发人员经常会遇到上述问题，而这些问题显着延长了免疫层析检测试剂的研发周期。为了了解如何解决上述问题，研究人员首先应牢牢掌握影响蛋白质与NC膜结合的各种因素，包括材料的固有特性及其预检测处理。
影响蛋白质吸附的因素：
在研究蛋白质捕获剂与NC膜的结合时，研究人员应考虑以下五个影响蛋白质结合机制的关键因素。
脴 工作缓冲液，用于溶解捕获的蛋白质；
脴NC膜用于固定捕获蛋白；
脴捕获蛋白质本身；
脴 一种用于在 NC 膜上点样捕获蛋白质的系统；
脴 捕获蛋白质点样时的环境湿度。虽然许多研发实验室已经彻底研究了免疫层析测定中使用的工作缓冲液和膜的特性，但他们不可能全面研究或优化他们使用的系统和捕获试剂。这些被忽视的步骤通常在开发之前就已考虑在内，因此在开发过程中几乎没有机会进一步调整。由于忽略了优化这些因素，开发人员常常专注于优化他们认为必须优化的内容。
捕获剂：随着检测项目的不同，用作捕获剂的蛋白质也不同。即使捕获剂略有不同，没有一种捕获剂与另一种捕获剂完全相同。也许这个因素很关键，因为不同的蛋白质捕获剂对不同的膜有不同的吸附能力。作为一种相对均一的蛋白质捕获剂，单克隆抗体可以相对简单地优化与NC膜的结合过程，而多克隆抗体含有针对大量不同抗原决定簇的抗体，并且不同抗体的最佳结合条件可能略有不同，从而导致蛋白质-膜结合条件的优化过程很复杂。例如，IgA和IgM存在结构或空间位阻等因素，难以优化其膜结合条件。例如，BSA、蛋白A、蛋白G由于化学性质或分子过大，很容易吸附在固相载体上，因此在NC膜上吸附非常困难。
仪器仪表：捕获剂喷雾系统仍然存在一些问题，并且大多数市售（捕获剂涂层、划线）仪器各有利弊。可变参数包括喷射给定体积的能力、接触条、垫或膜的能力、喷射速度和喷射后处理。体外诊断试剂生产企业需要的最佳解决方案是针对实际生产过程中面临的问题，如原材料问题、产能问题等找到最有效的解决方案。优化其他因素也可以优化特定的捕获线喷涂设备。
环境湿度：点胶时的环境湿度严重影响捕获线的质量，特别是对于喷膜系统。如果空气湿度过低，NC膜上会积聚静电荷，在NC膜表面喷涂蛋白质时会产生斑点，并且NC膜表面容易出现疏水性斑点。如果空气湿度过高，NC膜对捕获蛋白质的毛细管作用会加强，容易造成捕获线变宽或扩散。一般情况下，最佳点膜环境的相对湿度应保持在45-65%。为了保证原材料的均匀性，NC薄膜在贴片前应按照相应测试确定的最佳平衡时间在工作环境中进行平衡。
工作缓冲液的优化：由于蛋白质捕获剂种类繁多，不同蛋白质在工作缓冲液系统中的最大结合能力不同。影响点阵膜工作缓冲液的重要因素有两个。
脴 蛋白质溶解度（即用于吸附在NC膜上的蛋白质量）；
脴 蛋白质分子的稳定性（即聚集或溶解在水中的倾向）
为了保证有足够的蛋白质喷洒到捕获线上，首先必须将捕获蛋白溶解在点样缓冲液中，并且点样缓冲液保持一定的离子浓度以保证蛋白质的溶解度。虽然工作溶液的离子强度有助于控制捕获试剂的 pH 值，但它也会干扰结合蛋白质的静电相互作用。因此，确定维持捕获蛋白质足够浓度的最低可能离子强度至关重要。
如果特定浓度的蛋白质分子在溶液中稳定，它将溶解在溶液中。但如果其能量状态有利于形成固体，那么吸附到 NC 膜上的蛋白质就会多于稳定溶解在溶液中的蛋白质。这种能量状态可以用去稳定剂或沉淀剂诱导，但如果诱导过多可能会导致其他问题。如果蛋白质在点样膜之前沉淀，则整个试剂系统高度不稳定且几乎完全不可重现，导致吸附到 NC 膜上的剩余溶解蛋白质的量急剧减少，并且沉淀还会导致例如堵塞喷涂设备管道或NC膜微孔等问题。在某些情况下，蛋白质在点样过程中必须不稳定才能实现足够的蛋白质吸附，但也有一些例外。
上述分析表明，通过调整蛋白喷涂工作缓冲液体系的性质，可以改变蛋白质与NC膜的结合效果，其中核心性质涉及缓冲液中所用沉淀剂的离子强度、酸度和浓度。
离子强度：在给定的离子强度范围内，蛋白质溶解度随着工作缓冲液中盐浓度的增加而成比例增加。为了降低溶液中捕获的蛋白质分子的稳定性，溶液的离子强度应尽可能低，这样可以提高蛋白质与NC膜结合的速度。同时，开发人员还应该意识到，高浓度的盐会导致蛋白质沉淀，喷膜后干燥过程中的大量盐会干扰检测试剂的稳定性和灵敏度。
