揭示：使用辣根过氧化物酶 (HRP) 的技巧！
我们知道HRP是一种糖蛋白，分子量为44,000。由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉组成。中性糖和氨基糖约占18%，主要包括甘露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。每个HRP分子中含有一个血红素IX作为辅基，在波长403 nm处有最大吸收峰，而去除辅基的酶蛋白在波长275 nm处有最大吸收。
HRP在403nm处的OD值与275nm处的OD值的比值就是所谓的RZ值。RZ值仅表示HRP中血红素基团的含量，并不表示HRP制剂的真实纯度。而且，RZ值高的HRP制剂并不意味着酶活性高。
但酶浓度可以通过纯酶溶液在10mm光路波长、403nm处的吸光度来计算[1%(W/V)酶溶液的吸光度为22.5，浓度为227umol/L]。纯HRP在干燥并储存于±20℃时可保持稳定°C.以1.36 mol/L甘油、10mmol/L磷酸钠、30umol/L牛血清白蛋白和20umol/L细胞色素C(pH 7.4)溶液作为冻存基质。酶结合物稳定数年。
HRP 对热和有机溶剂相对稳定。用甲苯、石蜡切片处理或用纯乙醇或冰冻切片用10%甲醛水溶液固定均不会改变其活性。氰化物或硫化物在10-5~10-6 mol/L浓度下可逆性抑制HRP；氟化物、叠氮化物或羟胺仅在浓度高于10-3mol/L时才抑制HRP；HRP 也抑制 HRP。被羟甲基氢过氧化物不可逆地抑制。
强酸也是 HRP 的强抑制剂。因此，上述一些化合物，如氟化钠、叠氮化钠和强酸等，常被用作酶免疫测定中酶反应的终止剂。另外，在配制酶联免疫分析用稀释缓冲液时，应避免使用叠氮化钠作为防腐剂，以免酶失活。
HRP同工酶可分为三种主要类型：
①酸性同工酶，含糖量高。
②糖含量相对较低的同工酶，其等电点接近中性（或微碱性）。
③碱性（PI>11）同工酶，糖含量低。酶联免疫分析中使用的HRP主要由PI为8.7至9.0的所谓“C”同工酶组成，其他同工酶的活性很低。“C”同工酶的共价结构由两个紧密相邻的区域组成，血红素基团位于其间，形成三明治结构。糖链在八个不同的位点与多肽结合。天然酶携带很少的纯电荷；没有一个是免费的。-氨基，仅检测到2个组氨酸和6个赖氨酸，似乎全部被糖链壳覆盖。因此，HRP一般只有1～2个可供偶联的氨基。
根据HRP的催化特性，ELISA中一般采用过氧化氢（H2O2）作为HRP底物之一。在氢供体（即显色底物）存在的情况下，HRP 和 H2O2 之间的反应快速且特异。HRP被H2O2二价氧化形成复合物I，并且复合物I可以通过与氢供体的两个连续的单价相互作用被还原至其原始状态。复合物 II 是一种具有一个电子的氧化中间产物。当H2O2过量时，由于形成复合物III或IV（稍后补充），酶活性受到抑制。
30% H2O2 不稳定。由于H2O2既是HRP的底物又是HRP的抑制剂，为了使ELISA获得满意的测量结果，必须将H2O2限制在一定的浓度范围内，最终浓度通常为2～6mmol/L。但在实际研究工作中，这一点一般很少被关注。大多数研究人员使用的 H2O2 浓度通常比理想反应所需量高 2 至 4 倍。吸附在固相上的 HRP 比游离的 HRP 更容易受到过量 H2O2 的抑制。如果通过测量确认30%H2O2原液的浓度为30%，那么将其稀释10,000-12,000倍往往是理想的底物。H2O2的摩尔消光系数在10mm光程、240nm波长下为43.6。因此，可以通过这种方式检测H2O2工作液的浓度。
固相ELISA中，当温度高于20℃时°C、HRP活性往往较低。在底物溶液中添加非离子去污剂Polysorbate-20或TritonX-100可以延缓HRP的失活，使反应温度升高，但非离子去污剂对酶活性的保护作用因氢供体的不同而不同。例如，如果用2,2'-连氮基双[3-乙基苯并噻唑啉]-6-磺酸（ABTS）作为氢供体，只能保护20%的酶活性，而邻二茴香胺时(ODA)作为氢供体，对酶活性的保护提高到90%。
HRP之所以是迄今为止ELISA中应用最广泛的标记酶，主要是因为它易于提取且相对便宜；另一方面，它稳定、耐热、耐有机溶剂，可以与抗原或抗体偶联。此后，活动几乎没有损失。
