惊喜！优化NC膜和蛋白质有这样的技巧。
胶体金技术在传统诊断中发挥着不可估量的作用，已广泛应用于疾病、药物、食品、宠物、兽药的检测。随着胶体金标记技术的发展以及研发人员对胶体金快速检测技术的深入研究，市场上膜基快速免疫层析检测产品的种类迅速增加。
虽然免疫层析产品的包装设计有多种类型，但事实上，目前主流的商业检测试剂盒主要有以下两种形式。最常用的检测形式是侧流或色谱定量检测，通常用于诊所或直销客户。另一种检测形式是垂直点过滤，需要较强的操作技能，且仅限于研究用途。
无论试剂采用何种检测形式，生产灵敏且重现性好的检测试剂都需要试剂生产厂家采用有效的方法来配制检测线工作液。快速诊断试剂制造商通常对有关如何优化其检测线的文章感兴趣。这些文章可以帮助开发人员讨论蛋白质附着到硝酸纤维素膜上的基本原理，并强调开发人员在开发免疫层析试剂时面临的常见问题。由于蛋白质吸附到NC膜上的问题在侧向层析中很常见，因此本文重点讨论这一方面。
蛋白质吸附的重要性：
在免疫层析检测中，蛋白质被固定在NC膜上作为待测样品的捕获试剂。由于检测结果完全取决于捕获试剂在膜上良好的吸附效果，因此膜上蛋白质均匀且良好的吸附对于检测结果非常重要。
自从NC膜首次用于蛋白质吸附以来，人们对NC膜吸附蛋白质进行了大量研究，但NC膜吸附蛋白质的确切机制仍不清楚。尽管多种力在键合中发挥作用，尤其是疏水力、氢键和静电相互作用，但每种力的重要性和明显影响仍然难以捉摸。目前有两种合理的行动方式。第一个模型认为蛋白质最初通过静电相互作用吸附到NC膜表面，并通过氢键和疏水相互作用完成长期结合。尽管这个原理很难证明，但它与已发表文献的实验结论一致，也是最被接受的作用机制。
第二种模型认为，蛋白质首先通过疏水相互作用与NC膜结合，然后通过静电力与NC膜牢固结合。这种结合模型与大量已发表的文献结果一致。然而，静电相互作用机制无法为使用干燥或乙醇吸附方法在NC膜上长期稳定吸附蛋白质提供合理的解释。
无论蛋白质结合力如何平衡，研究人员在优化特定 NC 膜的蛋白质吸附时都必须考虑影响蛋白质吸附的所有力。这种观点不可避免地影响试纸条材料的选择及其加工工艺。例如，如果产品开发人员使用极大减少静电或疏水相互作用的缓冲液，则蛋白质的吸附能力将大幅降低。同样，蛋白质点样后充分干燥对于保证蛋白质长时间稳定地固定在NC膜上也非常重要。
制造商选择的材料可以有效地将蛋白质吸附到NC膜上。影响NC膜吸附蛋白质的材料通常有三类：非特异性蛋白质、影响静电相互作用和疏水相互作用的物质。常见的可以减少蛋白质结合的物质包括竞争蛋白质结合位点的其他蛋白质，如BSA、动物血清、干扰氢键形成的物质（如甲酰胺、尿素）以及影响疏水相互作用形成的物质（如如 Tween、Triton、Brij）。聚乙烯醇、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮等合成缀合物也会影响蛋白质结合。它们的作用机制可能是抑制一种或多种蛋白质与NC膜结合的结果。
如果NC膜上结合的蛋白量不足或者蛋白结合力不够强，就会出现相当多的问题，这在检测结果的检测线上会非常明显（如果蛋白量与膜的结合力太低，则结果中的检测线显色较弱，检测灵敏度降低，如果蛋白质不能牢固地吸附在NC膜上，在蛋白质吸附之前就会发生扩散。 NC膜，导致检测线变宽，显色变弱而不是明亮清晰，使得检测结果难以判读。在极端条件下，如果蛋白质与NC膜之间的物理吸附太弱，流动的蛋白质检测器和表面活性剂溶液可能会冲走NC膜上的固定蛋白质，导致显示范围变宽或根本不显示，测试线不清晰导致难以解读测试结果。
体外诊断试剂研发人员经常会遇到上述问题，而这些问题显着延长了免疫层析检测试剂的研发周期。为了了解如何解决上述问题，研究人员首先应该牢牢掌握影响蛋白质与NC膜结合的各种因素，包括材料的固有特性及其预检测处理。
影响蛋白质吸附的因素：
在研究蛋白质捕获剂与 NC 膜的结合时，开发人员应考虑影响蛋白质结合机制的以下五个关键因素。
脴 工作缓冲液，用于溶解捕获的蛋白质；
脴NC膜用于固定和捕获蛋白质；
脴捕获蛋白质本身；
脴 一种用于在 NC 膜上点样捕获蛋白质的系统；
脴捕获蛋白点时的环境湿度。
优化：
尽管许多研发实验室已经彻底研究了免疫层析测定中使用的工作缓冲液和膜的特性，但他们不可能全面研究或优化他们使用的系统和捕获试剂。这些被忽视的步骤通常在开发前经过深思熟虑，因此在开发过程中几乎没有机会进一步调整。通过不优化这些因素，开发人员通常会专注于优化他们认为必须优化的内容。,
1.捕获剂：随着检测项目的不同，用作捕获剂的蛋白质也有所不同。即使捕获剂略有不同，没有一种捕获剂与另一种捕获剂完全相同。不同的蛋白质捕获剂对不同的膜有不同的吸附能力，也许这个因素至关重要。作为一种更加均一的蛋白质捕获剂，单克隆抗体相对简单地优化了与NC膜的结合过程，而多克隆抗体则含有针对大量不同抗原决定簇的抗体，并且不同抗体的最佳结合条件可能略有不同，导致蛋白质与膜结合条件的优化过程相对复杂。例如，IgA和IgM存在结构或空间位阻等因素，使其难以优化其与膜的结合条件。例如，BSA、蛋白A和蛋白G由于其化学性质或分子太大，很容易吸附到固相载体上，使其很难吸附到NC膜上。,
2、仪器设备：捕集剂喷洒系统还存在一些问题。大多数市售仪器设备（捕获剂喷膜、打标）都有各自的优点和缺点。可变参数包括喷射给定体积的能力、接触条、垫或膜的能力、喷射速度和喷射后处理。体外诊断试剂生产企业需要的最佳解决方案是针对实际生产过程中面临的问题找到最有效的解决方案，比如原材料问题、产能问题等。优化其他因素也可以优化特定的捕获线喷涂设备。
3、环境湿度：点胶时的环境湿度严重影响采集线的质量，尤其是喷膜系统。如果空气湿度过低，NC膜上会积聚静电荷，导致NC膜表面喷涂蛋白质时容易出现斑点，NC膜表面也容易出现疏水性斑点。如果空气湿度过高，NC膜对捕获蛋白质的毛细作用会加强，容易造成捕获线变宽或扩散。一般情况下，点膜环境的最佳相对湿度应保持在45-65%。为了保证原材料的均匀性，在点胶膜之前，应按照相应测试确定的最佳平衡时间在工作环境中对NC膜进行平衡。
4.工作缓冲液的优化：由于蛋白质捕获剂差异很大，不同蛋白质的最大结合能力的工作缓冲液系统也不同。影响点膜工作缓冲的重要因素有两个。,
脴 蛋白质溶解度（即用于吸附到NC膜上的蛋白质量）；
脴 蛋白质分子的稳定性（即聚集或溶解在水中的倾向）
为了保证捕获线上有足够的蛋白质喷雾，首先必须将捕获蛋白溶解在点样缓冲液中，保持点样缓冲液中一定的离子浓度可以保证蛋白质的溶解度。虽然点膜工作溶液具有一定的离子强度，有助于控制捕获剂的pH值，但它也会干扰蛋白质结合的静电相互作用。因此，确定维持捕获蛋白质足够浓度的最低可能离子强度至关重要。
如果特定浓度的蛋白质分子在溶液中稳定，它就会溶解在溶液中。但如果其能量状态有利于形成固体，那么吸附到NC膜上的蛋白质的量就多于稳定溶解在溶液中的蛋白质的量。这种能量状态可以使用去稳定剂或沉淀剂来诱导，但过度诱导可能会导致其他问题。如果蛋白质在点样膜之前发生沉淀，则整个试剂系统将高度不稳定且几乎完全不可重现，导致NC膜上吸附的剩余溶解蛋白质的量急剧减少，并且沉淀还会引起诸如以下问题：如堵塞喷涂设备管道或NC膜微孔等问题。在某些情况下，蛋白质必须处于不稳定状态，才能在点样过程中实现适量的蛋白质吸附。在某些情况下也有例外。
上述分析表明，通过调整蛋白喷雾缓冲体系的性质，可以改变蛋白与NC膜的结合效果。核心特性涉及缓冲液中使用的沉淀剂的离子强度、酸度和浓度。
离子强度 在给定的离子强度范围内，蛋白质溶解度随着工作缓冲液中盐浓度的增加而成比例增加。为了降低溶液中捕获的蛋白质分子的稳定性，溶液的离子强度应尽可能低，这样可以提高蛋白质与NC膜结合的速度。同时，研究人员还应注意，高浓度的盐会导致蛋白质沉淀，喷雾后干燥过程中大量的盐会干扰检测试剂的稳定性和灵敏度。
