硝酸纤维素膜与蛋白质的结合原理、影响因素、配方、点样环境、密封、膜保存
1. 蛋白质与膜的结合原理
蛋白质与膜的结合原理，已知的结合力包括疏水力、H键、静电力等。确切的结合原理尚不清楚，主要有假说支持。有两个主要假设：
(1)首先，两者通过静电力结合，然后通过氢键和疏水相互作用长期维持。
(2)两者首先通过疏水作用结合，然后通过静电作用长期维持。
这两种假设都表明结合过程分为两个步骤，第一次结合和后来的长期结合。由于约束原则的模糊性，这方面的工作非常依赖于实践经验。
2. 膜对结合的影响
(1)膜孔径
有些技术人员倾向于用膜孔径大小来区分不同的膜，但请注意，这仅限于同一制造商的产品。如果产品来自不同的制造商，这种比较就没有意义。膜孔径与色谱速度之间的关系如上所述。
随着膜孔径减小，膜的实际可用表面积增加，膜结合蛋白的量也增加。用于估计表面积的参数是表面积比（实际可用表面积与所用膜的平面面积的比率）。
另外，膜孔径越小、层析速度越低，金标复合物通过T线的时间越长，反应越充分。
综合以上两点，得出的结论是膜孔径越小，灵敏度越高。但同时也减慢了运行速度，增加了非特异性结合的机会，即假阳性越高。因此，需要根据测试结果选择适合实际项目的膜，并找到合适的平衡点。
(2)不同厂家膜的差异
这个区别主要来自两点：
A. 生产薄膜时，所用聚合物和表面活性剂的来源、种类和用量不同。同样，这两类物质一般对膜处理性能影响较大。B、过程不同。
3、生物原料及缓冲液的试剂及配方
(1)生物原料的用途作为CT线的生物原料各不相同，这里仅作概述。首先，单克隆抗体与膜的结合优于多克隆抗体，主要是因为多克隆抗体有许多不同的表面位点，每个位点与膜的最佳结合条件略有不同，这无疑增加了优化难度。其次，分子量越大，蛋白质越难与固相材料结合。
(2) 缓冲器
或许大家最关心的就是获得性能优异的配方，包括缓冲液、封闭液等处理液配方。事实上，我无法为您提供通用食谱清单。因为不同的反应体系需要不同的配方支持，不同机构的反应体系也不同。要想钓“鱼”，先学会“钓”。为了不误导大家，我只就以下与公式相关的问题提供思路。具体公式请自行探索。缓冲液的组成一般为：PBS（或其他缓冲系统）+作用物质（针对特定问题）+pH调节。参考了之前的各种资料，我个人的看法是配方原则宜简不繁，活性物质根据自己的需要添加。由于膜制造技术的改进，许多过去需要添加的活性活性物质已不再需要。推荐的缓冲系统为0.01M PBS PH7-7.2，对各种抗原和抗体具有良好的适应性。活性物质的情况大致如下：少量NACL降低信号强度，消除假阳性。有机醇（甲醇、异丙醇等）润湿膜，减少膜上的静电，有利于粘合和涂覆。我个人不推荐，因为电影制作工艺的改进。表面活性剂（TW20、TX100），增加亲水性，避免空心线，增强色彩。
糖保护剂，减缓老化速度，还可以增加亲水性如上。将pH值调整到一定位置可以消除假阳性。
4. 采样环境
环境湿度对于点膜工艺非常重要。最佳湿度一般在45-65%之间。
如果湿度过低，薄膜上容易积聚静电荷，点状薄膜上容易出现散点，导致测试中出现疏水性斑点。如果湿度过高，胶片上的毛细管作用会加强，胶片上容易造成CT线变宽甚至扩散。为了保证加样时膜湿度的均匀性，加样前一般将膜置于湿度条件下一段时间。
5、采样仪器与膜表面的关系
目前有两种点样方法，薄膜划片和非接触点膜。非接触膜式优于擦拭膜式，进口擦拭膜式优于国产擦拭膜式。由于刮擦法是用软管将抗体刮到膜表面，而膜本身的物理性质又软又脆，所以刮管会在表面留下痕迹。进口薄膜划片机由于采用的材料和控制系统较好，留下的划痕较轻，而国产仪器较差，留下的划痕较严重。刮擦往往会对色谱金标记复合物形成抗性，从而导致假阳性。同时，跑板时T线位置很容易出现细线（鬼线），跑板结束后鬼线消失。
6. 薄膜宽度及点样位置
薄膜的宽度一般为18mm（或20mm）和25mm，分别用于测试条和测试板。但不同的T线采样位置会带来不同的灵敏度。随着点样位置上移，金标化合物通过T线位置的速度变慢，反应时间增加，灵敏度增加。反之，则灵敏度降低。该方法可用于改变灵敏度并消除误报。
7. 溶液在膜上的扩散
膜上溶液的样品体积一般为1ul/cm。膜上溶液的扩散趋于两端，喷出的是均匀的抗体溶液，但干燥时，线边缘的干燥速度高于中间。中间的抗体会继续向两侧扩散，所以干燥后，抗体会向线的两端聚集。一般情况下不会影响你的实验。如果你发现线条两端发红，中间发亮，就应该考虑这个问题了。可以通过添加上述活性物质来解决。
8、点膜前后封口效果
从供应商处购买的膜基本都经过优化，可以直接使用。然而，我们仍然经常遇到关于关闭的讨论。其实，倒闭并不像大家想象的那样，一旦倒闭，所有问题就迎刃而解了。老问题没了，新问题又来了，更麻烦了。我想说的是谨慎使用闭包。
我极其反对点片前关闭的做法。原因是厂家生产薄膜时，将各种配方混合添加到原浆中。然而，在封膜之前，必须将膜浸泡在封孔液中，这必然会扰乱膜内的正常物质分布。由此造成了许多问题，也降低了工作效率。有些厂家还遇到不密封就无法涂覆的问题。其实还可以用其他方法来解决问题。密封必须是下一个测试。我经常使用两种类型的闭包。流动被关闭并且作用物质在样品垫上被处理。将膜定点密封，将活性物质制成溶液，喷洒在膜的特定位置。该方法需要使用BIODOT的AIRJET喷嘴。不合格的半成品板可以复活。只要在膜上做了密封，就必然会影响产品的稳定性。具体影响程度需通过稳定性试验来判断。
9. 膜储存
新生产的膜通常含有 5-10% 的水分。关于膜的老化机制，有理论支持，但争议也比较大。其理论认为，膜的老化是由于膜上水分蒸发，使膜疏水、带电、变脆。存储膜一般要求避光、密封。太干或太湿都不好。在此储存条件下，一般可放置两年。但如果对膜进行封孔处理，则要根据具体的测试情况来判断。由于生产工艺的问题，有些膜在使用后一段时间内灵敏度会发生变化。如果遇到这个问题，需要在贴膜后放置一段时间，待稳定后才能调试生产。
