病毒分离鉴定步骤！
虽然动物接种、鸡胚培养、器官培养（如气管软骨环）、细胞培养等都可以用于呼吸道感染病毒的分离培养，但几乎所有病毒实验室都采用细胞培养来培养呼吸道病毒，而鸡胚培养物用于疫苗。生产中使用较多，实验室测试很少使用。
1. 步骤
病毒分离和鉴定的基本步骤根据病毒类型的不同可分为以下几种：
(一)病毒分离
1. 细胞系的选择
对于不同的呼吸道病毒，应选择敏感的细胞系/株进行培养。为了使培养的细胞适应各种病毒的分离和培养，可以建立混合培养细胞系，例如与水貂肺细胞（MV-1-Lu）和人腺癌细胞（MV-1-Lu）结合的R-mix细胞系。 A549）。用于甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒和腺病毒的分离和培养。
2.特殊的培养条件
(1)流感病毒：病毒侵入宿主细胞的前提是其血凝素被胰蛋白酶或类胰蛋白酶酶裂解。MDCK 传代细胞不产生此类酶。因此，为了帮助流感病毒进入MDCK细胞，需要在培养基中添加低浓度的胰蛋白酶。另外，培养基中的小牛血清会使胰蛋白酶失活，因此在接种病毒样本之前应使用无血清培养基或其他平衡盐溶液洗涤细胞。
（2）冠状病毒：针对不同的冠状病毒，选择不同的细胞系进行培养（表6-6）。值得注意的是，培养冠状病毒的温度稍低，为33-35℃°C
3. 细胞病变特征
(1)流感病毒：引起MDCK细胞的病变特点是细胞肿胀变圆、细胞间隙增大、核固缩或破裂，严重时部分或全部细胞脱落。
(2)副流感病毒：不同的副流感病毒的细胞病变特点不同，如感染hPIV-1的细胞变小、变圆等；感染hPIV-2的细胞容易发生细胞融合；感染 hPIV-3 的细胞容易出现桥状结构；感染hPIV-4的细胞容易发生整个单层细胞的变化，细胞肿胀、变圆、间隙增大，甚至脱落。
(3)呼吸道合胞病毒：细胞病的特点是细胞呈圆形和细胞融合。
(4)人偏肺病毒：接种后3～23天（平均17.3天）出现细胞病变效应。多数病变表现为小、圆形、颗粒状难治性细胞的出现，偶见合胞体病变。
(5)冠状病毒：SARS-CoV引起的细胞病变明显，细胞变圆、脱落。MERS-CoV引起的细胞病变在酸性条件下表现为细胞融合，在中性或微碱性条件下表现为细胞变圆和脱落。HCoV-229E、OC43、NL63病变较轻，细胞呈丝状，颗粒增多，呈圆形，散在细胞层，细胞很少完全破坏。
(6)腺病毒：细胞病变的特点是细胞先变圆形，后球形，折光性增强，许多病变细胞聚集成葡萄串。
(2)病毒鉴定与分型
1. 免疫学方法包括经典的中和试验、血凝抑制试验以及仍然广泛使用的各种免疫标记技术。这类检测方法的前提是要有针对该病毒的相应抗体，比如利用针对流感病毒核蛋白或呼吸道合胞病毒融合蛋白的抗体来判断是否是相应病毒，然后利用特异性抗体进行检测。抗血清型或确定特异性抗原类型。
2. 基于核酸检测的方法
(1)逆转录PCR：越来越多地用于病毒的鉴定和分型，可以有几种形式：
①实时荧光RT-PCR，使用不同的引物和探针，根据有无特异性扩增产物进行分型和鉴定。
②常规RT-PCR，采用通用引物和互补分型引物组合，扩增后进行电泳，根据扩增产物片段的大小可区分不同类型的病毒，如不同类型的呼吸道合胞病毒的G蛋白基因亚型。根据类型间变异较大的特点，设计了P1、P2、P3 3个引物。
P1是根据G蛋白基因5'端的核苷酸序列设计的。该区域的核酸序列在A和B亚型之间高度保守，是A和B亚型的通用引物。P2和P3分别位于核苷酸的3'端。，分别与 A 亚型和 B 亚型互补。如果是A亚型，P2和P1会一起扩增出一个277bp的片段。如果是B亚型，P3和P1会扩增出863bp的片段。PCR产物在琼脂糖凝胶中进行电泳，根据条带大小可判断A、B亚型。
(2)序列确定：通过序列比对进行识别和分型，根据系统发育树研究不同病毒的亲缘关系。随着测序技术的发展和成本的降低，该技术将得到更广泛的应用。
2、注意事项
(1)标本毒性鉴定及处置：
如果接种后1～2天内细胞迅速衰老，可能是由于标本中含有的有毒物质引起非特异性毒性反应。取0.2ml病毒（这是第二代病毒）接种到新的单层细胞上；②如果再次发生毒性反应，应将原始样品用PBS稀释并再次接种到同类型细胞中。
(2)污染及对策：
细菌污染很容易导致培养基混浊或细胞死亡，使受感染的细胞无法表现出细胞病变效应（CPE），或者真菌污染，培养基变酸，细胞无法正常生长。细菌处理不当，或操作污染，或培养基中抗生素浓度不足/无效。支原体污染，细胞形态无明显变化，培养基也不混浊，但细胞的生长特性、细胞膜组成或染色体会出现异常。因此，需要定期检测细胞是否被支原体污染。一旦被污染，被污染的细胞需要被丢弃。
(3)避免病毒交叉污染：
倒入接种病毒的细胞培养基时，应用移液器吸去液体，每一步都应更换新的移液器，避免剧烈震动产生气溶胶。
(4)盲传：
当培养7至10天后仍无细胞病变，或其他技术未显示培养物中存在相应病毒时，也收获培养的细胞，并再次接种细胞。盲传3代后，仍无细胞病变，或其他检查均为阴性时，可认为病毒分离阴性。
