什么是胶体金和免疫金？
A. 胶体金的性质及制备
(一)胶体金的结构
胶体金（colloidalgold）又称金溶胶（goldsol），是金盐还原为原金后形成的金颗粒悬浮液。胶体金颗粒由碱性金核（原子金Au）和双离子层包围，紧贴在金核表面的内层是负离子（AuC12-），外层离子层是分散的H+在溶液的胶体之间，以保持胶体金游离在溶液之间的悬浮状态。
胶体金颗粒的基金核并不是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本为圆球形，较大的胶体金颗粒（一般指30nm以上）多为椭圆形。在电子显微镜下可以观察胶体金的颗粒形貌。
(二)胶体金的性质
1 胶体性质 胶体金粒径在1～100nm，微小的金颗粒稳定、均匀，呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。因此胶体金具有胶体的多种特性，特别是对电解质的敏感性。电解质可以破坏胶体金颗粒外围的永久水化层，从而打破胶体的稳定状态，使分散的单个金颗粒聚结成大颗粒，并从液体中沉淀下来。某些蛋白质等大分子物质具有保护胶体金、加强其稳定性的作用。
2、着色微小颗粒胶体呈红色，但不同粒径的胶体着色有一定差异。最小的胶体金（2～5nm）呈橙色，中等大小的胶体金（10～20nm）呈酒红色，较大颗粒的胶体金（30～80nm）呈紫红色。根据这一特性，用肉眼观察胶体金的颜色可以粗略地估计出金颗粒的大小。
3、光吸收胶体金在可见光范围内有单一的光吸收峰，其光吸收峰波长（λmax）在510～550nm范围内，随胶体金颗粒的大小而变化，大颗粒的胶体金λmax有偏差胶体金λmax偏向长波长，反之亦然，小颗粒胶体金λmax则偏于短波长，表19-1是部分胶体金λmax。
(三)胶体金的制备
1.还原法胶体金制剂的制备方法。氯金酸（HauC14）为主要原料，常用的还原剂有柠檬酸钠、单宁酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。根据还原剂的种类和还原作用的强弱，可以制备0.8nm~150nm不等的胶体金。最常用的制备方法是柠檬酸盐还原法。具体操作方法如下：
(1)将HauC14先配制成0.01%的水溶液，取100ml加热至沸。
(2)在搅拌下准确加入一定量的1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7-2H2O)水溶液。
(3)继续加热煮沸15分钟。此时可以观察到，淡黄色的氯金酸水溶液在加入柠檬酸钠后很快变成灰色，然后变成黑色，然后逐渐稳定为红色。整个过程大约2~3分钟。
(4)冷却至室温后，用蒸馏水恢复至原体积。
用此方法可制备粒径16～147nm的胶体金。金颗粒的大小取决于制备时添加的柠檬酸三钠的量。表19-1列出了制备四种不同粒径胶体金时柠檬酸三钠的用量。
2. 注意事项
(1)氯金酸易潮解，应干燥、避光。
(2)氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此，配制氯金酸水溶液时，不宜使用金属勺来称量氯金酸。
(3)配制胶体金的蒸馏水应采用双蒸水或三重蒸馏水，或优质去离子水。
(4)准备胶体金的玻璃容器必须绝对干净，使用前应先用酸洗并用蒸馏水冲洗干净。优选采用硅化工艺，硅化方法可用5%二氯甲烷硅烷三氯甲烷溶液浸泡几分钟，用蒸馏水冲洗，然后干燥。
(5)胶体金的鉴定和保存：胶体金的制备并不困难，但要制作出质量好的胶体金却不是一件容易的事。因此，每次对好的胶体金都要进行检查，主要检查指标是粒径、粒径均匀度和有无凝集颗粒。
肉眼观察是最基本也是最简单方便的校准方法，但需要一定的经验。好的胶体金应该是澄清透明的，如果配制的胶体金浑浊或液体表面有漂浮物，表明配制的胶体金有较多的凝集颗粒。在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略地估计出所制成的金颗粒的大小。当然，也可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径。结胶体金的制备最好进行电镜观察，并选择一些有代表性的进行显微照相，可以更准确地测定胶体金的平均粒径。
胶体金在洁净的玻璃器皿中可长期保存，加入少许防腐剂（如0.02%NaN3）可有利于保存。保存不当会导致细菌生长或凝集形成颗粒。少量的凝集颗粒并不影响以后的胶体金标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。
二. 免疫金的特性及制备
（一）免疫金的特点
胶体金可以与蛋白质等大分子结合，在免疫组化技术中，习惯上将胶体金与蛋白质结合的复合物称为金探针。用于免疫测定的胶体金与免疫活性物质（抗原或抗体）结合，这种胶体金结合物常称为免疫金复合物，或简称为免疫金（immunogold）。
胶体金与蛋白质的结合机制目前还很清楚，一般认为是物理吸附。胶体金颗粒表面带有一层负电荷，与正电荷通过静电感应附着在蛋白质表面。因此，环境pH值和离子强度是影响吸附的主要因素，其他因素如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量和蛋白质浓度也会影响蛋白质的吸附。
(B) 免疫金的制备
1. 用0.2 mol/L K2CO3 或0.1 mol/L HCl 将胶体金溶液的pH 调节至选定值。原则上可以选择待标记蛋白质的等电点，而且要呈弱碱性。但通常最合适的反应pH往往需要通过多次试验来确定。
调整胶体金pH值时应注意，胶体金会堵塞pH计的电极，不可将电极直接插入胶体金溶液中，建议使用终浓度为0.15的聚乙二醇（PEG，20000）先稳定胶体金，再稳定胶体金的pH。
2. 将1/10体积合适浓度的蛋白溶液加入胶体金溶液中，室温反应2~5min。
由于盐成分会影响胶体金对蛋白质的吸附，并能使胶体金聚集下沉，因此待标记的蛋白质溶液中若含有高离子浓度，应在标记前先用低离子强度的蒸馏水透析去盐。
3. 添加浓度为 0.2% 的 PEG 或 BSA，使游离胶体金饱和。
4. 离心去除上清液中未结合的蛋白质。离心条件根据胶体金颗粒的粒径不同而不同：5nm金颗粒可选用40000r/min离心1h；8nm金颗粒25000r/min离心45min；14nm金颗粒以25,000r/min离心30min，40nm金颗粒以15,000r/min离心30min。
5. 轻轻吸出上清液。将沉淀用含有PEG或BSA的缓冲液悬浮，恢复原体积后离心。如此洗2至4次。彻底去除未结合的蛋白质。
6.最后将免疫金复合物用稀释剂制备至工作浓度以便储存。稀释剂通常是添加了稳定剂的缓冲溶液。缓冲溶液常用中性PBS或Tris缓冲液。
